甘蓝型油菜中两个互作NAC转录因子调控活性氧、叶片衰老以及抗逆的分子机理研究

NAC transcription factor gene family is plant-specific and plays important roles in plant growth, development, hormone response, as well as in enhancing stress tolerance towards drought, salinity and cold stresses and so on. In our previous research, we identified and cloned over 60 NAC genes from a double haploid cultivar of oilseed rape (Brassica napus L.) and studied the transcriptional activities, stress and hormone responses, subcellular localizations and functions of part of these genes. In this proposal, we plan to explore the molecular mechanisms of BnaNAC82 and its interacting partner, BnaNACa, which regulate accumulation of reactive oxygen species (ROS), leaf senescence and programmed cell death (PCD). We found that mutation of NACa renders seeds oversensitive to ABA during germination and post-germination growth. Moreover, the orthologous genes in Arabidopsis have not been studied in the context of ROS, senescence and stress tolerance, suggesting they are two novel members. Therefore, we are going to reveal the underling mechanisms of them in modulating ROS, ABA and stress tolerance, identify the cis-elements in their promoter regions, and assay the stress tolerance of transgenic plants. Through this work, we hope to dissect the roles of NAC82 and NACa in stress response and lay a solid foundation for utilizing NAC genes to improve crop resistance towards abiotic stresses, especially drought stress.

NAC转录因子基因家族是植物中特有的，在植物的生长发育以及多种逆境的耐受中发挥着重要作用。我们在前期研究中，系统地鉴定并克隆了双低油菜的一个双单倍体的60余个NAC转录因子基因，对其中部分NAC的转录活性、逆境响应模式、亚细胞定位以及功能进行了分析。本立项将对其中两个新发现的调控活性氧（ROS）的累积、叶片衰老的NAC82及其互作蛋白NACa进行功能与分子机制研究。此外，还发现NACa显著调控ABA敏感性与干旱的耐受性。这两个基因在拟南芥的直系同源基因在活性氧与抗逆中的功能未见报道。拟研究它们调控ROS累积、叶片衰老与干旱等逆境胁迫应答的分子机理，鉴定其下游信号转导通路的成员，检测它们表达水平的改变对干旱等非生物逆境的耐受性。这些研究内容将阐明油菜NAC82与NACa基因在逆境胁迫中的功能与调控机制，为有效利用NAC转录因子基因增强作物耐逆性具有十分重要的理论意义与应用价值。

NAC转录因子基因家族是植物中特有的，在植物的生长发育以及多种逆境的耐受中发挥着重要作用。叶片衰老是植物发育过程中的正常现象，但在农业生产中，叶片早衰会造成作物减产，而贪青晚熟则影响下一茬作物的种植。而且，叶片衰老引起营养物质的转移与循环再利用，与作物的产量与品质以及抗逆性密切相关。因此，探明控制作物叶片衰老的基因，探索其调控方法与技术，可以为农业生产带来巨大的经济效益与社会效益。在本研究中，我们对甘蓝型油菜中其中两个新发现的调控活性氧（ROS）的累积、叶片衰老的NAC60及其互作蛋白NAC82进行了功能与分子机制研究。BnaNAC60是一个具有跨膜结构域的转录因子，定位在内质网（ER）膜上，去掉跨膜区后的BnaNAC60ΔTM蛋白则定位在细胞核，发挥转录激活子的功能；衣霉素处理模拟内质网逆境或双氧水处理诱发氧化逆境可以明显地诱导BnaNAC60入核。双荧光素酶报告系统（Dual LUC）与凝胶滞缓分析（EMSA）分析发现BnaNAC60结合非经典的NTLBS元件。BnaNAC60的表达水平在油菜早期衰老与晚期衰老叶片中显著上调，同时，其表达受多种逆境处理的诱导，如盐害、干旱、脱落酸以及冷害等。 将BnaNAC60ΔTM分别在烟草叶片与油菜原生质体中过表达，可诱导活性氧（ROS）水平上升与出现类似超敏反应的细胞死亡。BnaNAC60ΔTM的过表达拟南芥植株比同样生长条件下同龄的对照组植物提前衰老。qRT-PCR检测表明转基因过表达植株中一些活性氧、抗病以及衰老相关标志基因的表达上调。Dual LUC分析发现BnaNAC60可以激活BnaNYC1、BnaRbohD、BnaNYE1、BnaZAT12以及多个BnaVPEs基因的转录，EMSA和ChIP-qPCR技术分别从体内和体外验证了BnaNAC60可以直接结合这些靶标基因启动子区的NTLBS元件。对于另外两个油菜NAC基因，即BnaNAC82以及同源基因BnaNAC46，也采用类似的技术，开展了研究，发现其表型更强，结合的顺式作用元件是经典的NACRS，鉴定出多个靶标基因并通过了EMSA与ChIP验证，但靶标基因与BnaNAC60相比略有不同。该工作阐明了油菜中NAC转录因子基因在叶片衰老与逆境胁迫中的功能与调控机制，为有效利用关键基因调控叶片衰老进程与增强作物对逆境的适应能力具有十分重要的理论意义与应用价值。