MAPK-WRKY信号通路调控植物钾营养利用的分子机理研究

Potassium mine is an unrenewable resource, and K+ concentration in the soil is an essential macronutrient limiting crop yielding and quality. It is an urgent requirement to study the molecular mechanisms how crop plants absorb and utilize K+, and to improve plants' K+ utilizing efficiency, with a final goal of ensuring the sustainable development of agricultural production. In our previous work, we have identified a novel WRKY transcription factor gene, WSLK1, which directly participated in K+ nutrition, through a combination of transcriptomic analysis of Canola root response to low K+ and phenotypic analysis of the orthologous gene mutants in Arabidopsis. Further, WSLK1 was identified to interact with itself, two other phylogenetically related WRKY proteins and a mitogen-activated protein kinase (MPK), as well as a small ubiquitin-like modifier (SUMO). We plan to study the regulatory mechanisms of low K+ stress mediated by WSLK1 and its interacting proteins. The proposed work includes: 1)screening the upstream transcription factor that binds to the low K+ responsive cis-element in the promoter region of WSLK1 gene; 2)understanding the molecualr mechanisms of MAPK-WRKY and SUMO-WRKY interactions in low K+ response; 3)analyzing the phenotypes of single, double and triple mutants of WSLK1 gene and its interacting partner genes, as well as the phenotype of WSLK1-overexpressing plants; 4)identifying the target genes of WSLK1 through microarray profiling and ChIP-seq analysis. Our work will not only illuminate a novel MPK-WRKY signaling pathway that regulates plant response to low K+ content, but also lay foundation to utilize key WRKY genes to improve crops' K+ utilizing efficiency in the near future.

钾矿是不可再生资源，土壤中钾离子含量是限制作物产量的大量元素之一。深入探索植物吸收利用钾离子的分子机理，提高作物的钾利用效率，是保障农业生产的迫切需求。我们前期对油菜与拟南芥的工作中鉴定了一个全新的、直接参与钾营养的WRKY转录因子-WSLK1，并发现它与另两个WRKY因子及一个MAPK激酶等有相互作用。本项目拟研究WSLK1转录因子及其互作蛋白在调控植物钾营养上的分子机理：1）筛选与低钾诱导WSLK1基因启动子特异元件结合的上游调控因子； 2）研究互作MAPK与SUMO蛋白调控WSLK1活性的机制；3）分析wslk1单突变体及与互作蛋白基因的多突变体、以及过表达植株的表型；4）鉴定WSLK1的下游靶标基因，阐明协同调控钾利用的机制。这些研究将不仅阐明一个全新的由MAPK-WRKY调控的钾营养信号转导途径，而且对有效利用关键转录因子基因增强作物钾利用效率等具有十分重要的理论意义与应用价值。

钾矿是不可再生资源，土壤中钾离子含量是限制作物产量的大量元素之一。深入探索植物吸收利用钾离子的分子机理，提高作物的钾利用效率，是保障农业生产的迫切需求。我们前期对油菜与拟南芥的工作中鉴定了一个全新的、直接参与钾营养的WRKY转录因子基因-WSLK1(WRKY sensitive to low potassium 1)，其T-DNA插入突变体对低钾处理高度敏感。本项目中，我们通过利用植物生理与分子生物学等的研究技术，对WSLK1的功能与分子调控机制进行了解析。酵母体内的转录活性分析发现，WSLK1是一个转录抑制子，能够结合经典的W-box元件，并且利用双色荧光报告基因（dual LUC）系统在植物体内进行了验证。酵母双杂交（Y2H）结合双分子荧光互补（BiFC）发现WSLK1能与自身、另两个WRKY转录因子、一个上游MAP激酶（MPK10）以及一个小分子类泛素蛋白(SUM3)相互作用。克隆了WSLK1的1kb的启动子，构建了与GUS报告基因的融合载体并转入拟南芥，发现WSLK1主要在根系以及维管组织内表达。利用CaMV35S启动子，获得了过表达WSLK1的转基因株系，发现WSLK1的表达影响了植物的生长与发育，导致叶形以及根系发育受阻，但对低钾处理的敏感性较野生型（WT）要低。利用Affymetrix的基因芯片，筛选低钾处理下WT与wslk1突变体之间在基因表达谱上的差异，发现141个基因在突变体中显著上调、85个基因显著下调（以1.5倍为cut-off）。通过实时荧光定量RT-PCR， 对其中的18个差异表达的基因（DEGs）的转录本的变化进行了检测，表现出与基因芯片数据较高的一致性。通过Motifsampler分析差异表达基因的启动子区的W-box顺式作用元件，发现在1 kb的启动子区域中具有明显的富集。继而克隆了多个钾离子通道与转运体蛋白基因的启动子，通过dual LUC, 进行了转录调控分析，鉴定了AtAKT1、KUP8等几个可能的直接的下游靶标。利用原核表达WSLK1-GST融合蛋白，使用电泳迁移变动分析（EMSA），发现WSLK1对AKT1等靶标基因的启动子区含有W-box的片段具有显著的结合能力。通过本研究，不仅阐明了一个全新的由MAPK-WRKY调控的钾营养信号转导途径，而且对有效利用关键转录因子基因增强作物钾利用效率具有重要的理论意义与应用价值。