肝吸虫幼虫鱼体内囊蚴形成的分子机制及干预研究

肝吸虫病是我国感染人数最多、流行范围最大的寄生虫病，该病主要由于食入含肝吸虫感染期囊蚴的淡水鱼和淡水虾而获得感染。近年来该病发病率逐年上升，已严重影响到流行区的人群健康和淡水鱼养殖业的经济利益。肝吸虫病史人兽共患寄生虫病，除人类外可感染40多种哺乳类动物，淡水鱼体内的囊蚴是人和哺乳动物共同的感染阶段，阻断鱼体内囊蚴形成，是切断肝吸虫传播途径的关键问题。本课题将在阐明肝吸虫幼虫鱼体内囊蚴形成机制的基础上，利用现代生物学技术筛选肝吸虫尾蚴入侵和鱼体形成囊蚴关键分子作为预防肝吸虫病疫苗候选分子，深入探讨枯草杆菌鱼用口服疫苗在预防肝吸虫病中的应用价值，为阐明肝吸虫尾蚴入侵淡水鱼及其在鱼体内形成囊蚴机制提供重要的科学依据，同时将预防人体肝吸虫病提前到预防淡水鱼感染肝吸虫阶段，既可有效切断肝吸虫病流行传播途径，又可保护淡水鱼养殖业的经济利益，将为实现防治肝吸虫病的目标提供新思路。

肝吸虫病患病率逐年上升，已严重影响到流行区的人群健康和淡水鱼养殖业的经济利益。淡水鱼体内的囊蚴是人和哺乳动物共同的感染阶段，阻断鱼体内囊蚴形成，是切断肝吸虫传播途径的关键问题。本课题利用现代生物学技术筛选肝吸虫尾蚴、囊蚴阶段特异表达或差异表达分子，利用干预研究的方法鉴定其是否为幼虫鱼体内成囊的关键分子，并探讨其机制。利用差异质谱分析和差异表达谱分析鉴定肝吸虫尾蚴、囊蚴差异表达或特异表达分子，发现肝吸虫囊蚴囊壁主要包括分子量为11-150 kDa的9种蛋白质。在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中获得4个囊蚴高表达或特异表达的分子副肌球蛋白（CsPMY）、亮氨酸氨基肽酶2（CsLAP2）、烯醇酶（CsENO）、半胱氨酸蛋白酶（CsCP）的融合表达蛋白，进一步探讨了表达在枯草杆菌芽孢表面的这4种蛋白口服免疫大、小鼠对其黏膜/系统、体液/细胞免疫的影响，以及其抗肝吸虫感染的效果。并将其口服免疫淡水鱼，检测鱼体的免疫应答情况，继而攻击感染肝吸虫尾蚴，检测鱼体内囊蚴形成情况，根据干预研究的结果初步探讨幼虫鱼体内成囊的关键分子及机制。结果显示，CotC-CsLAP2重组枯草芽孢口服免疫小鼠，能够刺激小鼠产生较强的局部黏膜免疫反应、系统体液免疫和细胞免疫反应。CotC-CsENO重组枯草杆菌芽孢口服免疫，能够刺激大鼠产生较强的局部黏膜免疫反应，系统体液免疫和非特异性免疫反应。CotC-CsENO和CotC-CsLAP2重组枯草杆菌芽孢口服免疫能够刺激草鱼产生体液免疫，并取得了良好的免疫保护作用。口服枯草杆菌芽孢增强了大鼠和草鱼肠道的黏膜免疫反应，并刺激肠绒毛生长，有助于外源蛋白的消化和吸收。每克饲料添加1×108个枯草芽孢的剂量既诱导了草鱼肠道的黏膜免疫反应，刺激了肠绒毛的生长，也没有对草鱼的肝脏生理机能产生损伤。在小鼠体内评价芽孢疫苗的效果发现重组芽孢CsCP疫苗灌胃给小鼠能激起一定的特异性系统免疫及局部黏膜免疫应答反应；重组芽孢CsCP疫苗对肝脏无毒副及损伤作用。不同剂量重组芽孢CsCP疫苗口服免疫草鱼，主要引起草鱼肠道及体表的黏膜免疫反应，以及部分的系统免疫反应。枯草芽孢CsCP口服疫苗对鱼的肝胰脏没有明显的损害。口服免疫了重组枯草杆菌芽孢的淡水鱼经检测未见肝吸虫囊蚴。本研究为阐明肝吸虫幼虫在鱼体内形成囊蚴的机制奠定了基础，同时为将肝吸虫病的防治提前到预防淡水鱼感染的阶段提供科学依据。