帕金森病发病机制中的DNA甲基化作用研究

DNA甲基化修饰是哺乳动物最重要的表观遗传改变之一，有研究表明PD发病与DNA甲基化修饰异常有关。本研究拟利用DNA甲基化芯片对α-synuclein转基因小鼠（A53T）和正常对照小鼠脑组织进行DNA甲基化分析，重亚硫酸盐测序法进行验证，获得感兴趣基因；应用重亚硫酸盐测序法在PD患者、正常对照进行感兴趣基因DNA甲基化修饰分析，ELISA试剂盒进行血清表达测定，探讨感兴趣基因DNA甲基化修饰和血清表达水平能否成为对PD具有诊断和反映病程进展的生物学标记物；应用Real-time PCR、HPLC等方法检测甲基转移酶mRNA的表达及活性和细胞内甲基供体的含量，探讨α-synuclein致感兴趣基因DNA甲基化异常的机制；通过基因过表达、RNAi等技术改变感兴趣基因的表达，探讨感兴趣基因表达异常对细胞生长、凋亡等生物过程的影响。从分子水平探讨感兴趣基因的甲基化与PD发病机制的关系。

本研究采用DNA甲基化芯片对α-synuclein A53T转基因小鼠和正常对照小鼠的中脑黑质脑组织进行DNA甲基化比较分析发现有3752个基因存在甲基化差异，涉及泛素蛋白酶、Wnt信号通路等多个通路，并通过重亚硫酸盐测序方法对感兴趣基因PARK5（Uchl1）及PARK15（Fbxo7） 的甲基化进一步验证证实这两个基因在α-synuclein转基因小鼠中甲基化水平显著下降（P值均<0.05）；此外，我们还同时采用DNA甲基化芯片对MPTP诱导PD模型小鼠和正常对照小鼠的中脑黑质脑组织DNA甲基化比较分析发现有44个基因存在甲基化差异，涉及信号转到、蛋白降解等多个通路，并通过重亚硫酸盐测序方法对感兴趣基因PARK5（Uchl1）的甲基化进一步验证，证实该基因在MPTP诱导PD模型小鼠中甲基化水平增加（P<0.05）；本研究进一步应用重亚硫酸盐测序法对散发性PD患者及正常对照外周血单个核细胞（PBMCs）中进行了α-synuclein基因内含子1区的甲基化分析，结果显示PD患者存在α-synuclein基因内含子1区的低甲基化（p<0.05），且α-synuclein转录起始点上游双核苷酸重复序列长度多态Rep1与其甲基化水平相关。为了深入探索基因甲基化异常的机制，本研究对MPTP诱导PD模型小鼠中脑黑质和散发PD患者PBMCs的DNA总体甲基化水平进行了分析，研究显示MPTP诱导PD模型小鼠中脑黑质甲基化水平较正常对照组显著降低（P<0.05），而DNA甲基转移酶（Dnmt1）、甲基化CpG结合蛋白Mbd1和Mecp2的mRNA表达水平显著增高（P<0.05）；在对散发性PD患者及正常对照PBMCs中DNA总体甲基化水平研究发现散发PD患者DNA总体甲基化水平降低（P<0.05），病程、年龄、发病年龄以及L-dopa使用对于本组实验对象DNA总体甲基化水平无显著影响（P>0.05），散发PD患者PBMCs中DNMTs及MBPs的mRNA表达水平均显著增高（P<0.05）。本研究通过对PD小鼠模型和PD患者外周血检测，证实在PD小鼠模型和PD患者外周血中存在着DNA总体甲基化水平的改变，同时证实了PD致病基因Uchl1、Fbxo7以及α-synuclein亦存在甲基化差异，这提示甲基化改变在PD发病机制中起到了重要作用。