新生小鼠OIR的miRNA表达谱及其靶基因对视网膜新生血管的影响

The pathogenesis of retinopathy of prematurity (ROP) is not completely clear.It's thought that relative hypoxia of the retina plays a main role in the pathogenesis of ROP. We will establish a Oxygen-induced retinopathy (OIR) model in new born mice and explore miRNA expressing profiling by the method of miRNA microarray hybridization. The miRNA targets in the ROP mouse model is predicted and identified through miRNA microarray hybridization.Recombinant plasmid and the mature miRNA is transfected into the ROP mouse model and then the number of retinal vascular morphology and angiogenesis of endothelial cells is quantified to analyze the neovascularization level. The study is designed to study miRNA expression profiling of neonatal mouse OIR model and the effects of miRNAs target gene on retinal neovascularization, acquire a better understanding of the pathogenesis of ROP retinopathy and find ROP drug therapeutic targets.of prematurity ROP.

早产儿视网膜病（Retinopathy of prematurity,ROP）的发病机制尚不完全清楚，目前认为视网膜相对缺氧所致新生血管形成在ROP发病机制中起主导作用。基于以上背景，本项目对新生小鼠氧诱导的视网膜病变（Oxygen-induced retinopathy,OIR）模型，通过miRNA芯片杂交技术，探寻新生小鼠OIR模型的miRNA表达谱。通过生物信息平台，对新生小鼠OIR模型的miRNA作用靶点进行预测，并对miRNA的靶基因进行鉴定。转染重组质粒和成熟miRNA入ROP小鼠模型后，恢复表达异常的miRNA，观察视网膜血管形态和新生血管的内皮细胞核数目来定量分析新生血管程度。本研究的意义在于通过对新生小鼠OIR模型的miRNA表达谱和miRNAs靶基因对视网膜新生血管影响的研究，更深入的理解ROP视网膜病变的发病机制，并对ROP药物治疗靶点研究提供直接可靠的依据。

本研究通过芯片杂交技术探寻了新生小鼠OIR的miRNA和lncRNA基因表达谱，并筛选出表达差异大的2个miRNA：miR-5107-5p和miRNA-130a-3p；6个lncRNA：XLOC_150632、XLOC_150636、XLOC_122045、XLOC_100454、XLOC_170009、XLOC_122042。并对所筛选出的miRNA和lncRNA进行了生物学分析，预测了它们的靶基因和信号传导通路，根据ROP的发病机制和可能存在信号传导通路筛选出PRKD3可能是miRNA-130a-3p的靶基因。随后研究组建立了miRNA-130a-3p过表达和沉默病毒，并对OIR小鼠进行了玻璃体腔注射，通过HE染色观察了突出视网膜内界膜的血管内皮细胞核数，通过心脏灌注荧光染色剂FITC，视网膜铺片观察其视网膜血管增殖情况，通过VEGF免疫组化的方法，观察对VEGF的影响： OIR小鼠注射了miRNA-130a-3p过表达病毒后，突出视网膜内界膜的血管内皮细胞核数显著减少，视网膜血管增生、扭曲情况得到了改善，VEGF的表达量明显减少；对照组小鼠注射了miRNA-130a-3p沉默病毒后，结果相反，说明miR-130a-3p可能是ROP潜在的治疗靶点。随后对OIR小鼠玻璃体腔注射三七总皂苷，发现注射后的OIR新生小鼠突出视网膜内界膜的血管内皮细胞核数减少，视网膜血管的扭曲、增生和无灌注现象改善，VEGF、 IGF-1 、PRKD3的表达量下调， miRNA-130a-3p的表达量上调，说明miRNA-130a-3p和PRKD3的表达在ROP中是一致的，PRKD3是蛋白激酶C中的下属分支，参与VEGF形成的传导通路，我们选取信号通路中的上下游VEGF受体EGFR和NF-κB两个基因，通过Real-Time PCR观察其基因表达量的变化，发现：EGFR、NF-κB的表达与miR-130a-3p、PRKD3的表达趋势一致，而VEGF的表达趋势与EGFR的趋势相反，说明三七总皂苷可能通过信号传导通路PRKD3作用于OIR新生小鼠的靶点miR-130a-3p达到治疗效果的，且治疗效果十分理想。结论：本研究筛选出了新生小鼠OIR的miRNA表达谱，预测了作用靶点miR-130a-3p及其靶基因PRKD3。提供了三七总皂苷治疗ROP基础研究，填补传统医学治疗ROP的空白。