膜联蛋白Annexin A1与Annexin A7在脑出血后继发性脑损伤中的作用机制研究

Blood-brain barrier (BBB) damage and excitatory amino acids toxicity after intracerebral hemorrhage (ICH) are important factors affecting the prognosis of ICH patients. The mechanism is unknown at present. There is a wealth of evidence suggesting that Annexin A1 and Annexin A7 may participate in the regulation of BBB permeability and excitatory amino acids toxicity. This project focused on exploring the roles of Annexin A1 and Annexin A7 in ICH-induced secondary brain injury. Firstly, we try to discover the mechanism at a cellular level. Gene transfection and RNAi are used to regulate the target genes expression, and then transwell assay, electron microscopy, high performance liquid chromatography, and patch-clamp technique were used to assess the changes in the phosphorylation of target proteins, BBB permeability and excitatory amino acids toxicity. Secondly, in brain slice from different genetic backgrounds, we use patch-clamp technique to study electrophysiological characteristics change. Finally, ICH model is established in transgenic mice and drug treated rats, and then we observe the changes of BBB permeability, excitatory amino acids toxicity, and assess the neurologic scoring. The longitudinal studies from three levels of cell, tissue and in vivo, horizontal researches from three levels of ultrastructure, electrophysiology and molecular biology in this study will provide us new ideas and theoretical basis to improve the prognosis of ICH.

血脑屏障破坏与氨基酸兴奋性毒性是导致脑出血（ICH）后继发性脑损伤的重要因素。有关报道及我们的预实验结果提示Annexin A1与Annexin A7可能参与到血脑屏障及谷氨酸引起的神经兴奋性毒性的调节中。本研究着重探索Annexin A1与Annexin A7在脑出血后继发性脑损伤中的作用。第一部分围绕细胞层面展开，在ICH体外模型中，通过基因定点突变和基因调控，结合transwell、电镜、高效液相色谱以及电生理技术，了解单层内皮细胞屏障作用和神经元兴奋性毒性的变化；第二部分围绕组织层面展开，通过活体脑片膜片钳技术，结合基因调控，评估电生理变化；第三部分围绕活体动物ICH模型展开，应用转基因和基因调控等方法，观察血脑屏障通透性和神经兴奋性毒性的变化。本研究纵向从细胞、组织和活体三个层面，横向从超微结构、电生理和分子生物学三个层面开展研究，将为改善 ICH 预后提供新思路和理论依据。

评估膜联蛋白A1（Annexin A1，ANXA1）和膜联蛋白A7（Annexin A7，ANXA7）在脑出血（intracerebral hemorrhage， ICH）后血脑屏障破坏及继发性脑损伤（SBI）方面的潜在治疗价值与深层的机制。大鼠脑血管内皮的免疫荧光及Western blot的ANXA1的表达量、血清的ANXA1的酶联免疫吸附试验ANXA1分泌的量在ICH后24h检测ANXA1值达最低，体外血管内皮细胞ANXA1检测量有类似变化。2、活体ICH尾静脉注射较高剂量人重组ANXA1（rhANXA1）的大鼠脑切片坏死、凋亡情况改善，高剂量组伊文思蓝含量较低、脑水肿程度减轻及白蛋白含量较低；体外过表达ANXA1的脑血管内皮细胞（BMVECs）在暴露于ICH刺激物较低表达组血脑屏障完整性较高。3、通过定点突变确定了两个磷酸化位点：（1）ANXA1的苏氨酸-24磷酸化与细胞骨架的肌动蛋白相互作用；（2）ANXA1的丝氨酸-27与ANXA1的分泌及ANXA1/FPR2相互作用相关；这两者对维持细胞骨架的完整性和细胞间通透性都是必不可少的。ICH后，ANXA7的表达显著上升，且与SNAP23/SNAP25相互作用增多，同时ICH后神经元凋亡和退化发生，脑组织水含量明显增加，血脑屏障的通透性开始增加。与ICH组比较，重组ANXA7 蛋白干预进一步加剧脑损伤，ANXA7抗体干预缓解脑损伤。另外一方面，通过检测我们发现ICH后脑脊液中的谷氨酸含量增高，应用ANXA7蛋白干预时，谷氨酸含量进一步上升，而应用ANXA7抗体干预时，则脑脊液中的谷氨酸含量较ICH组显著下降。综上，通过ANXA1的苏氨酸-24和丝氨酸-27的磷酸化可以防止ICH后引发的血脑屏障功能障碍。脑出血后ANXA1的磷酸化是脑血管内皮细胞的一种可能的自我修复策略；神经兴奋性毒性是ICH后SBI的重要因素，ANXA7参与其中，适当调控ANXA7的水平或者作用，将有利于减轻ICH后SBI。