TRPC1和TRPC4在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛中的作用机制研究

Cerebral vasospasm (CVS) is a serious complication of aneurysmal subarachnoid hemorrhage (SAH) with high mortality and morbidity. Since the pathogenesis remains elusive, no effective clinical therapeutic strategy for CVS is available now. Previous studies revealed that the contraction of vascular smooth muscle induced by calcium influx is a crucial cause for CVS after SAH. Also, transient receptor potential channel C (TRPC) is an ion channel protein located on the cell membrane, and it includes two subtypes TRPC1 and TRPC4 which can regulate the calcium influx. In this study, we take the special function of these two proteins as breakthrough point, and establish SAH model in cell, tissue and living animal model. The interventions of RNAi, gene transfection, medication and gene knockout are used in this study. Meanwhile, patch clamp, vascular tension evaluation, molecular biology and morphological observation techniques are applied to detect the TRPC1 and TRPC4's expressions, to observe the smooth muscle cells and vascular changes, and to quantify the calcium potential in SAH model. Finally, we can elaborate the roles of TRPC1 and TRPC4 in CVS. The expected study results will disclosure a new mechanism of calcium dyshomeostasis in vascular smooth muscle and an original abnormal signaling pathway in CVS. This study can provide us a novel clinical therapeutic strategy for CVS after SAH.

脑血管痉挛（CVS）是动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）的严重并发症，致死致残率高，目前在临床上缺乏有效的治疗手段。既往研究发现钙离子内流导致的血管平滑肌收缩是SAH后CVS的重要原因。瞬时受体电位通道C（TRPC）是一种位于细胞膜上的离子通道蛋白，其中TRPC1和TRPC4是调控钙离子内流的主要亚型，因此本研究以这两种蛋白质功能作为切入点，从细胞、组织和活体三个层面构建SAH模型，应用RNAi、基因转染、给予药物，以及基因敲除等干预手段，结合膜片钳、血管张力评估、分子生物学技术与形态学观察，测定SAH环境下TRPC1和TRPC4的表达，观察血管平滑肌细胞、内皮细胞以及血管变化，检测钙离子电位水平和浓度，从而阐明TRPC1和TRPC4在CVS发生过程中的作用，预期研究结果将揭示血管平滑肌和内皮细胞钙离子稳态失衡的新机制和CVS相关异常信号通路的新途径，为SAH后CVS的临床治疗提供新的策略。

已有研究表明瞬时电位受体钙离子通道1和4（TRPC1&4）参与到大鼠蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage ,SAH）后血管痉挛的发生发展中，但TRPC1&4在SAH后早期脑损伤（early brain injury, EBI）中的作用尚未见报道。本课题拟利用体内外SAH模型研究TRPC1&4的表达及其对神经元的影响。我们发现，SAH后EBI过程中，TRPC的蛋白水平于72小时表达最高。SAH后神经元的凋亡率和坏死率均显著上升，TRPC1&4下调进一步加剧神经元的凋亡和坏死；反之，TRPC1&4上调可以显著缓解神经元的凋亡和坏死。说明在SAH后EBI过程中，TRPC1&4可能作为一种内源的神经保护因子发挥作用。其次，N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）磷酸化后具有神经元毒性，有文献报道TRPC可以对NMDAR的磷酸化进行调控，而钙调磷酸酶（CN）也可以对NMDAR的磷酸化起到调控作用， CN与活化T细胞核因子（NFAT）的细胞定位密切相关。本课题拟利用CN拮抗剂(FK506)和激动剂(CHA)研究SAH后CN在TRPC1&4介导的神经保护作用，并探讨TRPC1&4与CN、NMDAR和NFAT之间的联系。我们发现， 在SAH后72h，TRPC1&4蛋白水平的上调后CN活性显著增高，TRPC1&4下调后CN活性显著降低。TRPC1&4上调后NMDAR的磷酸化程度降低，TRPC1&4下调后NMDAR磷酸化程度增高。SAH后72h，TRPC1&4的siRNA组NMDAR磷酸化水平升高，siRNA+CHA处理组 NMDAR磷酸化水平较siRNA组低；TRPC1&4的过表达质粒组NMDAR磷酸化水平降低，过表达质粒+FK506组NMDAR磷酸化水平较过表达质粒组高。CN活性上调后胞核内的活化T细胞核因子（NFAT）蛋白水平升高，同时细胞总蛋白中TRPC1和TRPC4的蛋白水平升高；CN活性下调后胞核内的NFAT蛋白水平下降，同时细胞总蛋白中TRPC1和TRPC4的蛋白水平下降。综上，在SAH后EBI过程中TRPC1&4的蛋白水平显著上升，随之CN活性增高，CN抑制NMDAR的磷酸化，从而阻断了磷酸化NMDAR的神经毒性。而当TRPC1&4被下调时，CN活性降低，NMDAR磷酸化程度增高，随之神经毒性加剧。