补肾促卵冲剂保护卵巢储备功能下降卵母细胞线粒体DNA氧化损伤的作用及机制研究

At present, there is an upward trend in incidence of diminished ovarian reserve(DOR). The onset age is younger and younger, which seriously influences women's life quality. However, the pathogenesis of DOR is still unclear. According to published reports, oxidative stress causes mitochondrial DNA(mtDNA) and mitochondrial function impaired. The occurrence of DOR is closely related with oxidative damage of mtDNA. Thus a novel important target of treating DOR is to reduce the oxidative damage of mtDNA and protect mitochondrial function. In TCM, Shen(kidney) deficiency and blood stasis were always fundamental pathogenesis through the emergence and development of DOR. In previous clinical and experimental research, Bushen Culuan Recipe modulates the axial function of H-P-O and influences the maturation of follicles. Therefore, we make oxidative damaged model occytes induced by H2O2 and DOR model rats induced by TWG tablets. Applying PCR, electron microscope technology and JC-1dyeing experiments to prove that oxidative stress causes dysfunction of oocyte mtDNA and mitochondrial function. Meanwhile to explore the mechanism of Bushen Culuan Recipe protecting mtDNA from ovarian tissue-oocyte-mitochondrion levels. The study will provide scientific theory basis for reinforcing kidney and removing stasis treating DOR ,which would have far-reaching influence in improving level of reproductive health and population quality.

目前，卵巢储备功能下降（DOR）发病率呈逐年上升趋势，发病人群日益趋向年轻化，严重影响着女性的生活质量，但其发病机制尚不明确。文献报道，氧化应激可造成细胞线粒体DNA（mtDNA）及线粒体功能受损。而DOR的发生与mtDNA氧化损伤密切相关，所以减轻氧化损伤保护mtDNA及线粒体功能可作为治疗DOR的重要新靶点。中医认为肾虚血瘀是DOR的主要病机，在前期研究中发现，补肾促卵冲剂通过调整下丘脑-垂体-卵巢轴，有明显的促排卵作用。因此，本课题采用H2O2诱导的氧化损伤模型卵母细胞和雷公藤多苷片制备的DOR模型大鼠，应用PCR、荧光电镜、JC-1染色等实验技术，证明氧化应激引起卵母细胞mtDNA及线粒体功能障碍，同时从卵巢组织-卵母细胞-线粒体层次探讨补肾促卵冲剂对DOR卵母细胞mtDNA的保护及其作用机制。本研究将为补肾活血中药治疗DOR提供科学依据，对提高生殖健康水平和人口素质具有深远影响。

随着人们生活方式的改变，不孕不育的发病率逐年攀升。卵巢储备功能低下（DOR）已经成为女性不孕不育的重要因素。DOR不仅影响患者的生殖健康和精神心理等，远期还可增加骨质疏松、骨折、心血管和内分泌代谢性疾病的发生风险。对于大多数哺乳动物而言，卵巢中原始卵泡的数量是相对固定且不可再生的，因此不论何种因素诱导DOR的发生，最终都可归咎于卵巢中原始卵泡库提前耗竭。因此，寻求有效治疗药物，积极改善卵巢储备功能、保护原始卵泡库是防治DOR的关键策略之一，这也正是中医“肾主生殖”和“治未病”思想的体现。.为了维持生殖寿命，卵巢中绝大部分原始卵泡都处于静息休眠状态，每个周期中只有极少一部分原始卵泡能激活进入生长卵泡池。其中，PI3K/AKT/mTOR通路在维持原始卵泡静息和启动募集过程中发挥着至关重要的作用，对于维持原始卵泡激活与休眠、存活与凋亡之间的动态平衡具有重要的意义。一旦原始卵泡过度激活进入生长卵泡池，将伴随着大量生长卵泡发生异常闭锁，其中Bax/Cyt C/Caspase-3通路在细胞凋亡途径中起着关键的调控作用，而氧化应激又是启动细胞凋亡程序的重要因素，Nrf2/ARE通路作为体内最为重要的抗氧化应激防御体系，在维持细胞稳定、抑制细胞凋亡等方面具有重要的作用。.本课题组前期研究发现肾虚血瘀是贯穿DOR发生发展全过程的基本病机，以补肾活血法为组方原则拟定补肾促卵方，长期临床证实疗效肯定安全无副作用。本研究通过雷公藤多苷构建DOR小鼠模型，筛选出最适造模及补肾促卵方浓度后，观察其对模型小鼠卵巢储备功能的保护作用，进而从分子角度深入探讨补肾促卵方通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路逆转雷公藤多苷诱导卵巢原始卵泡过度激活的作用机制，以及补肾促卵方通过激活Nrf2/ARE通路，抑制雷公藤多苷所致氧化应激对卵巢Bax/Cyt C/Caspase-3通路的激活，减少颗粒细胞凋亡，防止生长卵泡过度闭锁，从而起到保护卵巢储备功能的作用机制。