基于秀丽线虫的卵巢储备下降模型的构建及补肾活血汤对其的干预机制研究

Decreasing ovarian store (DOS) is one of the main reasons which affect female health and living quality. Bushen Huoxue Tang is fairly effective in the treatment of DOS, but the molecular mechanism of action is not very clear. The study aims to establish the model of DOS using the model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans), then analyze the mechanism of Bushen Huoxue Tang in alleviating DOS in Tripterygium Glycosides-induced DOS C. elegans. The effect of Bushen Huoxue Tang on oogenesis and oocyte quality is studied by observing oocytes development at different development stages and the number of unfertilized oocytes in one gonad arm. The molecular mechanism of Bushen Huoxue Tang in regulating the oocyte quality is explored by studying the TGF-β signaling pathway at molecular level, and three pathways (cell cycle, chromosome segregation, DNA damage repair) are also explored to identify the targets. In addition, using the modern biological information technique, the change in the expression level of homologous genes in TGF-β signaling pathway, cell cycle, chromosome segregation and DNA damage repair pathways between C. elegans and rat is studied, which further explore the feasibility of application of C. elegans in high-throughput screening and mechanism study for fertility-protective drugs.

卵巢储备下降是影响女性身体健康和生活质量的主要原因之一，补肾活血汤具有较好的临床疗效，但其分子作用机制尚不明确。本研究拟应用模式动物秀丽线虫构建雷公藤诱导的卵巢储备下降模型，并解析补肾活血汤对秀丽线虫卵巢储备下降的干预作用及分子作用机理。通过对秀丽线虫单侧性腺臂不同发育阶段卵母细胞和未受精卵母细胞的观察，研究补肾活血汤对秀丽线虫卵子发育和卵母细胞质量的干预作用。应用RT-qPCR技术，从分子水平研究调控卵母细胞质量的转化生长因子-β通路配体受体复合物的体内转运过程，从细胞周期、染色体分离、DNA损伤修复等方面进一步探讨其作用机制，揭示补肾活血汤的分子作用通路和靶点。应用生物信息学手段，研究秀丽线虫和大鼠卵巢储备下降模型中转化生长因子-β、细胞周期、染色体分离、DNA损伤修复等通路同源基因表达水平的改变，探讨秀丽线虫应用于生育力保护类药物筛检和机制研究的可行性。

近年，秀丽线虫逐渐应用于药理学领域，是研究药物效应作用及作用机制的具有重要潜在价值的研究模型。本项目尝试应用秀丽线虫对中药药理（以甘草为代表性中药）开展系统研究，并应用秀丽线虫构建雷公藤诱导的卵巢储备下降模型，并评价补肾活血汤对秀丽线虫卵巢储备下降的干预作用。.甘草在中药复方中应用广泛，起到调和诸药的功能，但其药理作用尚不是很明确。本研究应用0.12、0.18和 0.24 g/mL甘草作用于L1期幼虫直到其长到年轻成虫。结果显示0.12-0.24 g/mL甘草对线虫的24小时致死率、体长、运动行为、代谢、生育力、D型GABA能神经元、肠道荧光、肠道活性氧均无显著性影响。但预先应用甘草暴露于线虫，再让线虫经历热应激或百草枯应激，发现甘草在一定程度可减轻热应激或百草枯应激而导致的损伤。寿命试验显示甘草的延长暴露可以延长秀丽线虫的寿命。分子生物学研究显示甘草的延长暴露显著的改变了类胰岛素信号通路相关基因的表达。结果表明甘草具有一定的安全性和保护作用，可以延长寿命，而类胰岛素信号通路在其延长寿命的效应中发挥了一定的作用。.应用秀丽线虫构建雷公藤诱导的卵巢储备下降模型方面，应用雷公藤甲素（雷公藤多苷的主要活性物质）作用秀丽线虫4小时进行模型构建。结果显示暴露4小时后，中、高剂量组后代数目显著减少。且在生育期的第1天、第2天和第3天，中、高剂量组的排卵数都显著低于对照组，但是高剂量组和对照组每日排卵数的差别随着时间越来越小。暴露4小时后，中、高剂量组DTC细胞形态发生显著变化、有丝分裂区细胞数目显著减少、减数分裂loop区凋亡细胞数目显著增高，高剂量组线虫在生育期的第3天均出现未受精卵母细胞排出的现象。应用分子生物学技术研究细胞凋亡（ced-3、ced-4和ced-9）、细胞周期（cyb-3）以及DNA损伤修复（mlh-1）相关基因的变化。结果显示中、高剂量组ced-3显著升高，而ced-9显著降低，各浓度组的ced-4均显著升高。而中、高剂量组的cyb-3和mlh-1均显著降低。应用低、中、高三种浓度的补肾活血汤继续分别作用模型线虫24小时、48小时和72小时，结果显示补肾活血汤对雷公藤甲素引起的生育力下降具有显著的改善作用。结果提示应用雷公藤甲素构建秀丽线虫卵巢储备下降模型具有可行性；雷公藤甲素构建的秀丽线虫卵巢储备下降模型在评价补肾类中药复方的功能方面具有应用价值。