肠出血型大肠埃希菌VI型分泌系统核心跨膜结构组分的鉴定及组装研究

As a foodborne pathogen, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) can cause abdominal pain, diarrhea, hemorrhagic enteritis, HUS, and even death, when infected. By secreting shiga toxin, or other effectors transferred by certain secretion systems, EHEC exerts its virulence trait for hosts. A typical gene cluster encoding type VI secretion system was identified in strain EDL933, a typical strain of EHEC O157:H7 in silico. In EHEC, we confirmed that T6SS contributed virulence to BALB/c mice and was up-regulated when phagocytized by macrophage. An effector KatN was secreted to host cytoplasm by T6SS to regulate the ROS level, all resulted in a favorable environment for EHEC survival. Such finding was not reported in other bacterial pathogens. The special function of T6SS suggested special core structural components and transmembrane assembly in EHEC. In this project, we engage ourselves to fractionate pure and natural components from inner and outer membrane and periplasm in EHEC, through non-denaturing BN-PAGE, subjected to LC-MS/MS screen to define the core transmembrane structural components of T6SS. After validation of the interactions among such structural components, we can depict a complete T6SS assembly schematic, with some in-depth study of certain components. All the results will no doubt provide theoretical guidance for studying the unknown functions, regulation and new effector mining of T6SS in EHEC.

肠出血型大肠埃希菌（EHEC）是食源性病原菌，感染后能引发腹痛、腹泻、出血性肠炎和HUS等症状，甚至死亡。EHEC可通过分泌志贺毒素，或者其他分泌系统介导的效应蛋白来发挥毒力作用。我们在EHEC O157:H7的典型菌株EDL933的基因组上鉴定出VI型分泌系统（T6SS）的编码基因簇，证明T6SS有助于EHEC发挥对小鼠的毒力。当被宿主巨噬细胞吞噬后，EHEC可增强T6SS的表达，将底物KatN分泌至宿主胞内，降低细菌面临的氧化应激水平，利于生存。这一结论在其他物种中尚未发现。这种特异性提示其有独特的组分及在内外膜上的组装方式。本项目中，通过分离出高纯度的、天然的内外膜和周质组分，采用BN-PAGE和LC-MS/MS，可界定T6SS的核心跨膜组分并分析各组分间的互作关系网，描绘T6SS的结构图，并对几个结构组分深入研究。这些成果有助于进一步研究EHEC中T6SS的未知功能和底物挖掘。

肠出血型大肠埃希菌（EHEC）感染人体后，可导致患者腹痛、腹泻，常发展到出血性肠炎，进而引起尿毒综合征，甚至死亡。受污染食品可引起广泛而严重的流行病，极大地威胁着公共卫生体系。O157：H7是EHEC的典型血清型，在1982年首次被发现，在世界各地陆续有暴发，导致成百上千人感染和死亡。我国在1986年首次从徐州分离出O157:H7型EHEC，导致177人死亡。2000在河南省又发现35例感染病例，最终28人死亡。虽然世界各地十分重视O157:H7型EHEC感染的监测和防治，但对EHEC致病机制的认识并不充分。.T6SS（Type VI Secretion System）广泛存在于革兰阴性病原菌的基因组，并且与毒力相关。课题组前期研究发现EHEC的T6SS对小鼠有毒力效应。本项目旨在研究EHEC中，T6SS的主要结构蛋白组分及组装和发挥功能的方式。课题组成功地在已知的T6SS内外膜蛋白组分羧基末端连接了His标签，并分离出细菌内外膜组分，可用于相应膜蛋白复合物的鉴定。此外，TssB、TssK和TssM参与了T6SS组装和解聚过程。这三者可和其他结构蛋白形成天然复合物，构成T6SS的结构基础。课题组成功地在三者羧基末尾添加了His标签，从而有助于检测可能的T6SS组装复合体。在前期已有动物实验的基础上，本项目中课题组选用Δhns（T6SS高表达）和WT（T6SS正常表达）这2株菌，加上PBS对照，共3组处理，感染小鼠，收集小鼠粪便，提取DNA，进行微生物16S rDNA测序。通过研究不同处理，不同时间下小鼠肠道菌群丰度，总共鉴定到3543个OTU。通过分析各样本对应的肠道微生物分类情况和稀疏性曲线并比较群落相似度，我们发现Δhns菌株不仅影响小鼠生存，同时降低了小鼠肠道菌群多样性。Δhns组小鼠肠道微生物多样性与WT组在感染前期类似，明显弱于对照组。Δhns对小鼠毒力更强导致该组小鼠生存差，在第4天全部丧生。Δhns高毒力的发挥，与降低小鼠原有肠道寄生菌生物多样性有关。WT组小鼠在后期其肠道菌群趋于恢复。山梨醇麦康凯平板涂布与计数显示，感染后期WT菌株逐渐被正常肠道定植菌取代。本研究的科学意义在于阐明了EHEC表达T6SS等毒力因子，抑制了小鼠肠道的微生物多样性，从而对小鼠表现出毒力。