缺氧条件下Ⅱ型分泌系统对肠毒性大肠埃希菌LT毒素分泌的调控研究

Enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC) is a kind of a major pathogen which threat to human health. ETEC colonized in small intestine and release of virulence factors cause severe diarrhea. It was prooved that the virulence factors LT was secreted by type secretion system, so the mechanism study on the T2S system is important to ETEC infection control and prevention, even useful to the theoretical stady. However, previous study were focus on the aerobic condistions, which is different to intestinal environment. It is difficult to reflect the true state, that ETEC intestinal regulation of LT virulence factors secretion. In order to improve this condition,we simulated intestinal hypoxia environment and constructing the gene deletion strans and fusion expression vector. The ablity of LT virulence factor secration and cell adhesion efficiency will be evaluated by in vivo and vitro study, to found the regulation mechanism of T2S system on LT toxin secretion under intestinal hypoxia environment and the mechanism of LT toxin secretion affected by host enternal nutrition substances.

肠毒性大肠埃希菌（ETEC）是威胁人类生命健康的重要病原体，主要通过在人体肠道内定殖并分泌毒素导致严重腹泻。已证实LT毒素是ETEC的主要致病因子，它通过Ⅱ型分泌（T2S）系统分泌，因此研究T2S系统对LT毒素分泌的调控机制，对于ETEC感染防控具有重要意义。然而前期T2S系统的体外研究集中在有氧条件下进行，与ETEC感染部位，即肠道内的缺氧环境和营养状况截然不同，因此无法真实反映T2S系统在肠道内调控毒力因子分泌的真实状态。根据前期实验，我们发现人工缺氧环境下LT毒素在细胞周质中积累，但终端电子受体的加入却能够恢复LT毒素的分泌。提示缺氧环境与肠内代谢产物均可影响LT毒素的分泌。本研究将模拟肠内缺氧环境，通过构建基因缺失株和融合表达载体，对LT毒力因子分泌能力分别进行体外和体内研究，最终揭示宿主肠内营养物质对LT毒素分泌的影响机制，发现肠内缺氧环境下T2S系统对LT毒分泌的调控规律。

肠毒性大肠埃希菌（ETEC）是威胁人类生命健康的重要病原体，通过在人体肠道内定殖并分泌毒素导致严重腹泻。然而前期ETEC的体外研究集中在有氧条件下进行，与感染部位，即肠道内的缺氧环境和营养状况截然不同，因此无法真实反映ETEC在肠道内分泌毒力因子的真实状态。在该项目的资助下，本团队在模拟体外缺氧条件下，利用特异性抑制剂、基因敲除菌株及互补株构建等试验方法，以及ELISA、westernblot、蛋白芯片和分子生物学等实验技术研究了肠内无氧条件对ETEC治病表型以及毒力因子表达调控的分子机制。本研究共设计了三部分研究内容。第一部分： 由于LT毒素通过Ⅱ型分泌系统（T2SS）分泌，但是本研究发现体外缺氧环境中ETEC无法分泌LT毒素，而加入肠内代谢中间产物（例如TMAO和硝酸盐）可恢复LT毒素在无氧条件下的分泌。研究发现，终端电子受体能够在特异性电子受体还原酶（NarG或TorCAD）存在的情况下特异性地诱导GspD蛋白发生多聚体化从而使T2SS具有分泌功能，而这一过程依赖于导航蛋白YghG的参与。以上结果说明TMAO和硝酸盐能够在无氧条件下通过完成呼吸链电子传递实现T2SS的组装从而实现了LT毒素在肠内无氧条件下释放的。第二部分：我们研究了在缺氧条件下，肠毒性大肠杆菌hns和stpA基因对LT毒素表达调控的影响，研究发现：在体外有氧条件下hns基因敲除有效促进了LT毒素的表达；而在缺氧条件下，hns和stpA双敲除有效促进了LT毒素的表达，但H-NS功能回补的hns单敲除株不能有效抑制LT毒素的表达。结果提示H-NS与StpA对LT毒素表达调控具有重要作用，而且有氧与缺氧环境中发挥作用存在差异。第三部分：研究了LT毒素对肠上皮细胞生长抑制和凋亡的影响，研究发现，LT毒素能够产生肠上皮细胞毒性，导致肠上皮细胞凋亡，这一过程有内质网应激信号（PERK-eIF2-ATF4-CHOP）通路参与。通过抑制CHOP表达，可以减少LT毒素诱导的肠上皮细胞（HCT-8）凋亡。除此之外，我们还研究了缺氧条件对ETEC生物致病性的影响，包括生长速度、粘附效率和MIC，发现缺氧环境下终端电子受体能够恢复ETEC的致病性，但其机制仍需进一步研究。