黑线仓鼠及其白化突变系(A:CHA)内体－溶酶体运输系统差异表达基因对黑色素形成的影响及机理研究

The lysosomal transport system play a crucial role in the biogenesis and transportion of melanin. However, relatively little is known about this system up to now. The albino mutant of cricetulus barabensis (A:CHA) is a new model of albinism. Our previous work suggested that this mutation might due to the lysosomal transport system. In this subject, based on our previous work of supression subtractive hybridization and next-generation sequencing of transcriptome of A:CHA and cricetulus barabensis,the different expressed genes of the lysosomal transport system between A:CHA and cricetulus barabensis will be identified. Appling the MNT-I cells, the different genes which have prominent effect on the formation of melanin will be screened by the RNA-mediated interference technique. The effect of these different genes on the key enzymes in the formation of melanin, the ultrastructure and the markers of melanosome and the cargo transport complexs of melamin will be studied.The expression and its rules of these genes in the skin of cricetulus barabensis and its albino mutant will be analysed. Further,5-10 key genes in the formation of melanin will be selected and the difference of their composition will be studied.This subject will be helpful for finding the the mutation mechanism of A:CHA, expanding our knowledge about the functions and mechnisms of lysosomal transport system, developing the pinciples of melanin and providing references to the study of human albinism.

内体－溶酶体运输系统在黑色素的形成和运输中发挥重要作用，但目前对该系统还缺乏深入了解。黑线仓鼠白化突变系（A：CHA）是一种新的白化突变模型，课题组前期工作发现其白化突变与内体－溶酶体运输系统有关。本项目拟在前期抑制性差减杂交文库测序和转录组高通量测序基础上，确定二者内体－溶酶体运输系统差异表达的基因。以MNT-1细胞为对象，利用RNA干扰技术筛选出对黑色素形成有影响的差异基因；分析这些基因对黑色素合成的关键酶、黑色素小体超微结构和标志物，以及黑色素形成相关货物运输复合物的影响；分析这些基因在黑线仓鼠和A:CHA皮肤组织表达量和表达规律的差异；确定5-10种关键基因，比较它们在黑线仓鼠和A:CHA组成的差异。通过本研究，不但可以明确A:CHA白化性状产生的原因，而且可以深入了解内体－溶酶体运输系统在黑色素形成过程中的作用及其机理，促进黑色素相关理论的发展，为人类白化相关疾病的研究提供参考。

先后利用转录组测序技术和mRNA消减杂交实验分析了黑线仓鼠和白化仓鼠皮肤表达差异的基因。将黑线仓鼠和白化仓鼠进行互交，选择F3代性状分离的子代仓鼠，利用RNA-Seq技术分析黑色个体和白色个体皮肤基因的表达差异。利用荧光定量RT-PCR和Western-blot的方法验证了上述表达差异的基因。完成了2只白化仓鼠的基因组重测序工作，共获得27032个外显子区域的SNP，其中有37个转录提前终止的突变可能与白化性状相关； 在外显子区域发生Indel突变的基因，共有72个。利用克隆测序的方法，对37个转录终止和72个Indel突变进行了分别的验证，确定了MATP基因为白化仓鼠白化性状产生的原因。白化仓鼠的MATP基因组序列，在3`端缺失1300个碱基。缺失的序列包括MATP基因的3`端非翻译序列和第一外显子的部分编码序列，其编码框缺失131个碱基。对白化仓鼠的MATP基因的转录情况进行了分析，白化仓鼠的MATP基因可以正常转录，并且阅读框没有发生变化，只是在N端缺失71个氨基酸。分别利用针对MATP蛋白N端和C端的抗体，对黑线仓鼠和白化仓鼠MATP蛋白的表达情况进行了分析，发现MATP蛋白N端的表达量明显降低，与预期结果一致。取黑线仓鼠和白化仓鼠的皮肤组织，制作切片进行透射电镜观察。白化仓鼠与黑线仓鼠相比，成熟的黑色素小体少，且体积较小，着色较浅。利用Western-blot的方法对黑色素形成过程中的关键TYR、TYRP1、TYRP2、PMEL和Mart1等基因的表达情况进行了分析，发现MATP基因的N端缺失对TYRP1和成熟的PMEL17蛋白具有明显的影响。上述结果表明，MATP基因对TYRP1的稳定性和黑色素小体的成熟具有一定的影响。利用Crispr/cas9技术建立了MATP基因完全敲除的B16F10细胞模型和C57小鼠敲除模型，为MATP基因功能的深入研究奠定了基础。