去甲斑蝥素对系膜细胞增殖与凋亡的影响及分子机制的研究

Relative lack of apoptosis in mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN) is an important reason for proliferation of mesangial cells abnormally. Norcantharidin（NCTD） has the role of inducing cell apoptosis, immune regulation and anti-fibrosis, so it has potential applications for treatment of immune-associated nephropathy. Our previous studies found that： NCTD can effectively prevent renal tubulointerstitial fibrosis by significantly down-regulating expressions of CTGF and NF-κBp65. So our project plans are as following: ①In vitro, human glomerular mesangial cells(HMC) induced by TGF-β1 are incubated with the different concentrations of NCTD. HMC proliferation, apoptosis and cell cycle will be detected. MAPK family and its signaling pathways (ERK, JNK and p38) are analyzed to probe mechanism on HMC apoptosis. ②MsPGN animal models with NCTD intervention, will be detected including renal pathological changes and the effect of NCTD on apoptosis of renal tissue and its molecular mechanism. In the experiments of vitro and vivo，we could Systematically explore the effect of NCTD on mesangial cell proliferation, apoptosis and its regulatory mechanism.It will provide new evidences for NCTD to treat chronic kidney disease.

系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）中相对性凋亡不足是导致系膜细胞异常增殖的重要原因。去甲斑蝥素（NCTD）具有诱导细胞凋亡、免疫调节及抗纤维化的作用，在治疗免疫相关性肾病方面具有潜在的应用前景。我们前期研究发现：NCTD干预肾病大鼠可降低尿蛋白水平，下调肾组织结缔组织生长因子（CTGF）和NF-κBp65的高表达、减轻肾间质纤维。在此基础上，本项目计划①在TGF-β1诱导人肾小球系膜细胞（HMC）增殖的条件下，以不同浓度NCTD体外干预，观察其对HMC增殖、凋亡及对细胞周期的影响及机制；分析MAPK 家族及其信号传导通路（ERK、JNK、p38）对HMC凋亡的影响。②NCTD干预MsPGN动物模型后，观察肾脏病理改变，NCTD对肾组织细胞凋亡的影响及其机制。通过体外及体内实验相结合的方法系统探讨NCTD对系膜细胞增殖与凋亡的影响及其调控机制，为NCTD用于慢性肾脏病防治提供新证据。

目的:利用体外培养人肾小球系膜细胞和系膜增生性肾小球肾炎大鼠模型，探讨去甲斑蝥素（NCTD）对系膜细胞增殖与凋亡的影响及其调控机制。 研究内容：（1）体外：培养人肾小球系膜细胞（HMC），分对照组和不同浓度NCTD干预组，MTT测细胞增殖；PI及Hoechst染色测定细胞凋亡；流式细胞分析细胞周期的变化。遂予胎牛血清（FBS）诱导HMC增殖建立细胞模型。不同浓度NCTD干预后，MTT测细胞增殖；Hoechst染色测细胞凋亡；JC-1荧光探针检测HMC线粒体膜电位的变化；ELISA检测HMC胞浆Cyt-C 表达。（2）体内：SD大鼠分别BSA灌胃、注射四氯化碳及脂多糖,建立肾炎模型后给予不同浓度NCTD干预；第8周末处死大鼠,检测血常规及生化指标;肾组织行光镜、电镜及TUNEL染色。 结果：（1）体外：MTT示NCTD呈时间-剂量依赖抑制HMC增殖(P＜ 0.05)，凋亡测定示NCTD与凋亡率呈时间-剂量依赖。建立细胞模型后NCTD 对FBS诱导的HMC的增殖呈抑制作用，其抑制率呈时间-剂量依赖关系（P＜0.05）；Hoechst染色示NCTD干预后各实验组不同程度地出现凋亡小体，其凋亡率具有时间-剂量依赖的特点；JC-1 荧光探针示HMC线粒体膜电位随NCTD 暴露浓度的升高显著下降（P＜0.05）；ELISA 酶联免疫吸附示NCTD干预后能显著增加细胞色素C释放量。（2）体内：模型组各时间点尿蛋白量、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、肾小球细胞增殖程度积分、小管间质病理损伤积分均显著升高(P＜0.05)；电镜示模型组系膜区扩大，可见基质弥漫增生伴系膜细胞增殖；NCTD干预后,肾炎大鼠上述指标均显著降低(P＜0.05)；电镜示系膜细胞及基质增殖均明显减轻；TUNEL示系膜细胞出现凋亡。各组间ALT、AST及血常规差异均无统计学意义。 结论：1、NCTD可抑制人肾小球系膜细胞的增殖和诱导HMC凋亡。2、NCTD 对FBS诱导的HMC有明显抑增殖和促凋亡作用，呈现时间-剂量依赖性。3、NCTD可通过降低 HMCs 线粒体膜电位并使Cyt-C释放至胞质中启动HMC的凋亡程序，最终诱导其凋亡。4、NCTD能降低肾炎大鼠尿蛋白，抑制系膜增生，减轻小管间质损伤，逆转急性肾功能不全，且无肝毒性及骨髓抑制等严重不良反应。