Mus81通过CHK2/Mus81/p53信号传导通路调控肝细胞癌化疗敏感性的机制研究

化疗敏感性的调控是目前肝癌化疗研究的重点。我们前期在国际上首次发现，DNA损伤修复的关键核酸内切酶Mus81在肝癌发生发展中发挥重要作用。最近的研究则提示Mus81与肿瘤化疗敏感性密切相关，但其作用机制尚不清楚。根据最新的研究进展，我们推测Mus81很可能通过CHK2/Mus81/p53这一信号传导通路发挥其调控肝癌化疗敏感性的作用，但目前未见相关的研究报道。因此，本项目拟采用siRNA及基因转染技术，改变肝癌细胞系HepG2中Mus81的表达并观察其化疗敏感性的变化。同时，我们拟采用实时定量PCR、流式细胞检测、免疫荧光及激光共聚焦显微镜等技术，深入研究Mus81调控肝癌化疗敏感性的信号传导通路。继而建立小鼠肝癌化疗模型，从活体水平研究抑制Mus81表达对肝癌化疗敏感性的影响。通过上述研究，本项目将阐明Mus81调控肝癌化疗敏感性的分子作用机制，并有望获得新的肝癌化疗增敏分子干预靶点。

本项目首先采用慢病毒介导的siRNA技术，构建了Mus81基因表达干预的肝癌细胞系- HepG2Mus81(-)细胞系（干预效率达到70%以上）且发现该细胞系的生长及集落生成能力均明显下降，细胞凋亡率明显上升（达70%以上），而细胞周期则无明显改变，若将Mus81基因重新导入HepG2Mus81(-)细胞则可明显下调其凋亡率，提示干预Mus81基因可促进HepG2肝癌细胞的凋亡从而抑制其生长增殖。我们还发现丝裂霉素、顺铂、阿霉素、表阿霉素及5-氟尿嘧啶等肝癌常用的化疗药物对HepG2Mus81(-)细胞的IC50明显低于HepG2Control细胞（感染对照慢病毒颗粒的HepG2细胞），其中又行以顺铂的逆转倍数为最高（达到41.67），提示干预Mus81基因可有效提高肝癌细胞的化疗敏感性。我们进一步的研究发现，顺铂处理后HepG2Mus81(-)细胞的凋亡率及Caspase-3蛋白活性水平均明显高于HepG2Control细胞；且随着顺铂处理时间的延长，磷酸化p53的表达水平的上升较HepG2Control细胞更早，峰值也更高；若采用CHK2抑制剂预处理后再行顺铂处理，则可进一步上调HepG2Mus81(-)细胞凋亡率、Caspase-3蛋白活性水平及磷酸化p53的表达水平，提示CHK2/Mus81/p53这一信号传导通路在肝癌化疗敏感性调控中发挥了重要作用。进而，我们建立了裸鼠肝癌化疗模型，发现HepG2Mus81(-)细胞所形成的的裸鼠肿瘤体积明显小于HepG2Control细胞，其肿瘤组织中Mus81的表达明显低于HepG2Control细胞，磷酸化p53的表达水平则高于后者，这在活体动物层面进一步验证了干预Mus81对肝癌化疗敏感性的调控及其机制。通过上述研究，本项目在国际上首次证明干预Mus81可促进肝癌细胞凋亡及有效提高肝癌化疗敏感性，并初步阐明了CHK2/Mus81/p53这一信号传导通路在后者中发挥的重要作用，由此获得了一个新的抑制肝癌生长及提高化疗敏感性的分子干预靶点。经过本项目的实施，我们目前已发表SCI收录论文3篇，其中1篇影响因子> 3分，同时正在积极准备材料申请专利。