拟南芥保卫细胞质体醌介导气孔关闭的叶绿体基质pH相关胁迫应激启动机制

The chloroplasts of plant guard cells contribute to stress stimuli-induced stomatal closure, however, the mechanism involving signal transduction of this process is not well understood. Recently, we proved that the reduced state of plastoquinone (PQ) pool initiated the production of chloroplastic hydrogen peroxide (H2O2), which was calcium sensing receptor (CAS)- dependent and was required for extracellular calcium-induced stomatal closure. An emerging question on how to initiate the process of (PQ) pool-driven chloroplastic H2O2 synthesis in guard cell was raised. In our review paper, we suggested that stress stimuli-induced change in stromal pH of guard cell chloroplasts was the potential mechanism initiating such process. In this project, we will develop transgene Arabidopsis lines that have stable expression of pH sensitive GFP in chloroplast stroma to reveal the changes of stromal pH of guard cell chloroplasts under the treatments with diverse stimuli and drugs. In addition, analysis of chloroplastic H2O2 production and stomatal aperture combined with data of Arabidopsis cas mutant lines can we further understand the potential relation between CAS, PQ pool and stromal pH in guard cell during stimuli-induced chloroplastic H2O2 synthesis and stomatal closure. Our project will provide deeper insight into the mechanism on the regulation of guard cell chloroplasts in stomatal movements and the area on functional studies of plant cell.

植物保卫细胞叶绿体与胁迫因子引发的气孔关闭过程有关，但目前该过程中信号转导机制的有待探索。我们的研究结果揭示，在钙受体CAS参与下还原态质体醌介导叶绿体过氧化氢H2O2的产生是外界钙信号引起气孔关闭的关键途径，且也很可能与其他胁迫因子引起的气孔关闭有关，但如何启动还原态质体醌引起叶绿体H2O2的产生则是一个新的问题。我们在发表的综述中提出胁迫因子引起的保卫细胞叶绿体基质pH变化是启动该过程的潜在机制。本项目将构建在叶绿体基质中稳定表达pH敏感型GFP的拟南芥，用于观察不同胁迫因子和药剂作用下保卫细胞中叶绿体基质pH的变化情况。结合保卫细胞叶绿体H2O2的产生和气孔运动以及拟南芥cas突变体的数据，进一步解析CAS蛋白、质体醌和叶绿体基质pH值三者在胁迫因子引起叶绿体H2O2产生和气孔关闭过程中的关系。该研究结果能让我们深刻理解保卫细胞叶绿体控制气孔运动的机理，深化植物细胞功能领域的研究。

本项目中我们推测胁迫因子引起的保卫细胞叶绿体基质pH变化是CAS参与下启动还原态质体醌引起H2O2的产生和气孔关闭的主要机制。本项目构建了细胞质和叶绿体基质中稳定表达PRpHluorin的拟南芥，用于观察不同胁迫因子以及药剂等引起保卫细胞细胞质和叶绿体基质pH的变化情况。本项目同时结合保卫细胞H2O2的产生和气孔运动以及拟南芥cas突变体的数据，进一步解析CAS蛋白、质体醌和细胞pH值三者在不同胁迫因子引起H2O2产生和气孔关闭过程中的关系，揭示还原态质体醌关闭气孔的机理。.研究结果表明通过将NADPH依赖性硫氧还蛋白还原酶C前85个氨基酸加到PRpHluorin蛋白之前，能够有效地将PRpHluorin在拟南芥野生型和cas突变体叶绿体中的稳定表达。在获得细胞质和叶绿体基质稳定表达PRpHluorin拟南芥植株后，我们成功建立了活体保卫细胞细胞质和叶绿体基质的pH与PRpHluorin荧光比率的线性关系。通过测定细胞质和叶绿体基质pH值我们发现，脱落酸、钙离子、flg22、强光和茉莉酸以及细胞碱化剂均能引起野生型和cas突变体细胞质的碱化，但是除了强光和细胞碱化剂外其他均无法显著提高叶绿体基质的pH值，而质体醌还原剂和细胞酸化剂可迅速降低细胞质和叶绿体基质的pH值。通过表皮条分析发现，钙离子、脱落酸、flg22、茉莉酸、强光和质体醌还原剂以及细胞碱化剂均能促进保卫细胞H2O2的产生和气孔关闭，但这些过程均受到细胞酸化剂的抑制。另外，CAS蛋白的敲除则抑制了部分刺激物如钙离子、flg22、强光和质体醌还原剂的作用，但是无法抑制脱落酸、茉莉酸以及细胞碱化剂的作用。.这些结果表明细胞质和叶绿体基质pH的变化不是胁迫因子通过CAS和还原态质体醌启动保卫细胞H2O2产生和气孔关闭的主要原因，这与我们先前推测的机制不同。但是实验又表明人为改变细胞的pH值的确能影响H2O2产生和气孔的运动。虽然我们按计划研究了胁迫下叶绿体基质pH变化情况，但依然没有解决胁迫刺激下还原态质体醌启动H2O2的产生和气孔关闭的理论问题。我们猜测这很可能与叶绿体类囊体中的pH变化有关，目前正开展新的研究来进一步揭示相关机理。