UV-B辐射诱导拟南芥气孔关闭过程中异三聚体G蛋白调控保卫细胞S-型阴离子通道活性的作用机制研究

Many studies have shown that heterotrimeric G proteins mediate a large number of factors-regulated stomatal movement via controlling guard cell S-type anion channels. However, little is known about its mechanisms and its roles in the ultraviolet B (UV-B)-induced stomatal closure. Based on the previous results that G protein subunits GPA1, AGB and AGG1 as well as S-type anion channels SLAC1 and SLAH3 are all involved in the UV-B-induced stomatal closure, we will study the following two main questions in this project: First, by studying the interaction between G proteins and S-type anion channels and its effect on channel activity, we elucidate whether G proteins directly regulate S-type anion channels via their interactions in the UV-B-induced stomatal closure. Second, among protein kinases which have been shown to directly regulate the S-type anion channels by previous studies, we determine which protein kinases participate in the UV-B-induced stomatal closure. Then, we further elucidate whether G proteins regulate the S-type anion channels via its interaction with the protein kinases to control the protein kinases’ subcellular localization, activity or its interaction with S-type anion channel. This study will help us to further understand the signal transduction mechanisms of UV-B radiation and the mechanisms of G proteins regulation of ion channel activities.

研究表明异三聚体G蛋白通过影响保卫细胞S-型阴离子通道活性参与了多种刺激调控气孔运动的信号转导过程，但关于其作用机制及其在UV-B诱导气孔关闭中的作用却知之甚少。本项目在前期研究已探明G蛋白亚基GPA1、AGB1和AGG1以及S-型阴离子通道SLAC1和SLAH3参与UV-B诱导气孔关闭的基础上，一方面通过研究G蛋白与S-型阴离子通道的互作及其对通道活性的影响来阐明UV-B诱导气孔关闭过程中G蛋白是否通过与S-型阴离子通道的互作而直接调控通道活性；另一方面，在前人已表明的直接调控S-型阴离子通道活性的蛋白激酶基础上，筛选参与UV-B诱导气孔关闭的蛋白激酶，然后研究UV-B诱导气孔关闭中G蛋白是否通过与蛋白激酶的互作而调控了激酶的亚细胞定位、酶活性或激酶与S-型阴离子通道的互作进而影响了S-型阴离子通道的活性。该研究有助于深入理解UV-B辐射的信号转导机制和G蛋白调控离子通道活性的作用机制。

研究表明动物中G蛋白直接调控的一类重要的下游效应器为离子通道。植物中通过对G蛋白功能缺失突变体的分析表明G蛋白介导多种刺激调控气孔运动与其影响了慢型阴离子通道和内向整流K+通道的活性有关，但目前关于植物G蛋白调控这些离子通道活性的分子机制及其在UV-B诱导气孔关闭中的作用并不清楚。本项目首先利用气孔分析法研究了G蛋白不同亚基在UV-B诱导气孔关闭中的作用，结果表明G蛋白α亚基GPA1、β亚基AGB1和γ亚基AGG1以及S-型阴离子通道SLAC1和SLAH3均作为正调节因子参与了UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程，且GPA1的作用在信号分子H2O2和NO的上游，而AGB1和AGG1的作用在H2O2和NO的下游。然后，利用酵母双杂交、双分子荧光互补和pull-down技术的研究表明GPA1和AGG1/2/3均能与慢型阴离子通道SLAC1和SLAH3以及内向整流K+通道KAT1互作，而AGB1不能与这些离子通道互作；且GPA1与这些离子通道互作的关键区域为跨膜区，而AGG1/2/3与这些离子通道互作的关键区域为胞内侧。最后，用双电极电压钳技术在非洲爪蟾卵母细胞中检测了G蛋白对SLAC1和KAT1通道活性的影响，结果表明：各种G蛋白亚基、Gβγ二聚体和G蛋白三聚体均不能直接激活SLAC1的通道活性，但能抑制OST1或CPK21对SLAC1通道活性的激活作用，Gβγ二聚体也能显著抑制内向整流K+通道KAT1的通道活性。这些结果说明Gβγ二聚体介导UV-B等刺激诱导气孔关闭或抑制气孔开放并不是通过G蛋白与S-阴离子通道互作而直接诱导其通道开放来实现的，而是通过与内向整流K+通道直接互作而抑制其通道的开放来实现的；同时该结果还暗示动物和植物G蛋白与Shaker类型K+通道互作的方式及其对通道活性的调控方向明显不同：动物中与K+通道直接互作的G蛋白亚基是Gβ亚基，且互作诱导了通道的开放，而在植物中与K+通道直接互作的G蛋白亚基是Gγ亚基，且该互作是抑制了通道的开放。