差异蛋白组学分析葫芦茶酚类成分对含CTX-M和fosA3大肠杆菌作用机理研究

Escherichia coli were easy to produce antimicrobial resistance. We found that active phenolics of Gourd tea distributing Lingnan area had strong bacteriostatic effect and no drug resistance, but its mechanism and drug targets were not clear. In this paper, CTX-M and fosA3-Producing Escherichia coli as a model, proteomics technology would be used to research the action mechanism of Gourd tea extracts on drug-resistant Escherichia coli and targets of drug action from multiple perspectives. Effects of Gourd tea extracts on protein production during bacterial growth, reproduction and metabolism were studied by differential proteomics method, antibacterial mechanism hypothesis was put forward in in this paper. Then scanning electron microscopy (SEM),RT-PCR, flow cytometric method and western blot were used to observe the effects of Gourd tea extracts on bacterial cell wall, cell membrane and protein synthesis by analyzing changes of alkaline phosphatase (AKP), conductivity, extracellular protease, protein synthesis related enzymes and gene expression. By using Fourier transform infrared spectrometer(FTIR), ultraviolet spectroscopy, circular dichroism spectroscopy and fluorescence spectrum, the influence of Gourd tea extracts on DNA, alpha-helix , beta sheet and fatty acid synthesis were analyzed, the action mechanism of Gourd tea extracts on bacteria resistance from many aspects was clarified to provide a theoretical basis for exploring new drug targets and new drugs research.

大肠杆菌易产生耐药性，本实验室前期研究发现岭南药材葫芦茶的酚类有效成分具有较强的抗菌性且无耐药性，但其作用机制和作用靶点尚未阐明。本课题以含CTX-M和fosA3大肠杆菌为模型，拟采用蛋白组学技术多角度研究葫芦茶提取物对耐药大肠杆菌的作用机理和药物作用靶点。通过差异蛋白组学方法探测药物对细菌生长、繁殖、代谢等环节蛋白质生成的影响,提出中药抗菌机理假设；再采用扫描电镜、RT-PCR、流式细胞仪、western blot等方法验证药物作用前后对细菌碱性磷酸酶（AKP）、电导率、胞外蛋白、蛋白合成有关酶和基因表达等因子变化分析中药对细菌细胞壁、细胞膜和蛋白质合成影响；通过傅里叶红外光谱仪、紫外光谱、圆二色谱和荧光光谱分析中药提取物对DNA、蛋白α螺旋、β-折叠、脂肪酸合成的影响，多角度阐明葫芦茶酚类对耐药菌作用机理，为探索中药的作用靶点和新药开发提供理论依据。

由于植物多酚的广谱抗菌作用，近年来，关于植物酚类在耐药菌防治应用方面的研究越来越多，且取得了一定成果。但是，中药成分复杂，各成分之间相互协同是它发挥作用的优势。本试验采用响应面法优化葫芦茶酚类的超声提取工艺：液料比30 ：1（mL/g），超声功率160 w，温度40℃，时间20 min，乙醇溶度60%，葫芦茶酚类提取率达30.3708 mg/g。将已知的五种葫芦茶酚类成分（水杨酸、原儿茶酸、没食子酸、对羟基桂皮酸和绿原酸）进行组合，得到31种复合物，31种复合酚酸对7株不同的大肠杆菌都有一定的抑制作用，其中复合酚酸19表现出的抑菌效果最好（MIC值：原儿茶酸0.834 mg/mL，对羟基桂皮酸0.208 mg/mL，绿原酸1.67 mg/mL），该复合酚酸对鲍曼不动杆菌和金黄葡萄球菌也有抑菌活性。对于含CTX-M-9和fosA3耐药基因的大肠杆菌，复合酚酸19与头孢曲松钠、阿莫西林、磷霉素、磺胺间甲氧嘧啶、加替沙星、林可霉素、氟苯尼考、头孢噻肟钠和利福平联合时均表现出相加作用。复合酚酸19能够有效的抑制含CTX-M-9和fosA3耐药基因大肠杆菌的生长；通过胞外ATP酶活性和可溶性蛋白的检测，发现复合酚酸19破坏了细胞壁和细胞膜，改变细胞膜的通透性，使大分子物质从细胞中漏出，TEM观察处理后的细菌形态证实了这个结果。此外，复合酚酸19可以降低胞内核酸含量，抑制或消除含CTX-M-9和fosA3耐药基因大肠杆菌总蛋白的合成，主要影响约55 kDa片段大小的蛋白条带。经TMT定量蛋白组学研究发现，亚抑菌浓度的复合酚酸19处理后与空白对照组相比，总共有268个差异表达蛋白（Fold change=1.3, p＜0.05），其中上调蛋白84个，下调蛋白184个。在KEGG信号通路中对差异蛋白富集注释后发现：脂肪酸降解、苯丙氨酸代谢、赖氨酸代谢、双组分系统、细菌趋化性、群体感应等信号通路显著富集，且复合酚酸19显著下调膜蛋白及相关耐药基因蛋白的表达。本项目发表文章21篇，中文核心12篇，5篇SCI，会议论文1篇，其他文章3篇。