基于金纳米探针的三联HBV-HCV-HIV抗原蛋白超灵敏检测新技术研究

Although the risk of infectious disease transmitted through blood transfusion has decreased as the development of viral nucleic acid amplification testing (NAT), the protein detection testing is still indispensable. The sensitivity of protein detection method is the bottleneck in blood screening. In this study, A new assay modified from gold nanoparticle probe-based assay (GNPA)that was constructed in previous study will be developed for ultra-sensitive detection of trace HBV-HCV-HIV antigen proteins. Three single-stranded signal DNA strands will be designed to prepare HBV-HCV-HIV gold nanoparticle probe (NP) coated with the viral polyclonal antibodies. HBV-HCV-HIV magnetic microparticle probe (MMP)will be prepared through being coated with anti-HBV, HCV and HIV monoclonal antibodies. The assay captures HBV, HCV and HIV antigen using the NP and MMP to form immuno-complex. The signal DNAs coated onto the NP present in the immuno-complex then be detected by multi-real-time fluorescence PCR using a TaqMan probe and chip-based detection. The characteristics of the assay such as specificity, sensitivity, reproducibility, stability, comparing with NAT and ELISA and "serus panel"sample detection will be further evaluated. The research of the assay is the essential part in blood screening technology study, and it is significant of promoting the development of blood screening technology and ensuring for blood viral safety.

血液病毒核酸检测技术的发展降低了传染性疾病经输血传播的危险性，但血液病毒蛋白筛查仍然不可替代。蛋白检测的灵敏度是血液病毒免疫学筛查的瓶颈。本项目旨在将前期建立的单联金纳米探针痕量蛋白超灵敏检测技术运用于血液病毒免疫学筛查技术研究中，建立三联HBV-HCV-HIV抗原蛋白金纳米探针检测新技术。主要包括：设计单链条形码DNA-1、DNA-2、DNA-3，结合HBV、HCV、HIV多抗进行标记筛选制备三联HBV-HCV-HIV金纳米探针（NP）；利用HBV、HCV、HIV单抗标记筛选制备三联HBV-HCV-HIV磁球探针（MMP）；优化MMP-被检物-NP免疫复合物形成体系；建立免疫复合物（含条形码DNA）三重荧光PCR及银染检测技术；评估特异性、敏感性、重复性、同类方法比较和"血清盘"样品检测等。本研究是血液筛查技术研究的重要组成，对推动血液病毒血清学筛查技术的发展和保障血液病毒安全意义重大。

血液病毒核酸检测技术的发展降低了传染性疾病经输血传播的危险性，但免疫学筛查技术仍是血液筛查技术研究的重要组成部分，抗原蛋白检测的灵敏度是免疫学筛查的瓶颈，血液病毒抗原蛋白超灵敏检测技术研究仍然滞后。生物条形码检测技术是研究较早的一种纳米金探针分子检测技术，为痕量蛋白的超灵敏检测研究开辟了一个新的技术平台。本研究将新型生物条形码检测技术（BCA）应用于重要血液病毒抗原蛋白检测，旨在建立HBV、HCV、HIV抗原蛋白新型BCA超灵敏检测技术。.研究中，分别设计筛先了用于HBV、HCV、HIV新型BCA中所用的3条长度均为60bp的条形码DNA1、DNA2、DNA3，进行了BLAST比对分析鉴定。通过基因克隆技术构建了pMD-barcode DNA1, pMD-barcode DNA2 and pMD-barcode DNA3重组载体，并分别制备了DNA1、DNA2、DNA3的重组质粒标准品。分别建立了DNA1、DNA2、DNA3的荧光定量PCR技术，并建立了DNA1、DNA2的二联荧光定量PCR技术，检测灵敏度为10copies/μl条形码DNA。初步建立了HCV核心抗原蛋白的新型BCA/荧光PCR检测技术，对HCV核心抗原蛋白的检测灵敏度为1fg/ml，显著高于ELISA的灵敏度（2ng/ml）。为进一步降低新型BCA技术对DNA的非特异性结合，改善假阳性问题，我们探索性地开展了HIV新型BCA/银染检测技术研究，这一方法中，利用被检物抗体标记制备NP探针（不标记条形码DNA），并采用银染法对形成的免疫复合物进行鉴定，目前尚处于技术建立与优化中。.本研究中申请国家发明专利1项（公开号CN105176987A, 2015-12-23），发表中文期刊论文3篇（1篇为会议增刊），投稿修回SCI论文1篇（Journal of virological methods, revised），参加全国性学术会议3次，其中做大会报告2次。.本研究为BCA技术的进一步改进与完善提供了研究基础，随着新型BCA技术假阳性、稳定性等问题的解决，将为痕量血液病毒抗原蛋白超灵敏检测提供可靠的检测手段，对推动血液病毒安全保障意义重大。