基于金属微纳结构荧光增强效应DNA测序新方法研究

Fluorescent DNA sequencing has been extensively applied to life science. The low fluorescence quantum yields and high background scattering of present methodology have, however, limited the application of most existing fluorescent dyes in DNA sequencing. A complicated bioluminescent procedure with multiple enzymes has to be applied as a conventional procedure for the purpose. In this project we propose a simple implement scheme by designing a kind of metallic micro-nano structures to achieve higher sensitivity for DNA sequencing based on surface plasmon resonance effect. Our research contents are as follows: 1) Design and synthesis of orderly and controllable metallic micro-nano architectures that could be used to generate surface plasmon resonance; 2) Study on the optical properties of plasmon resonance field and evaluation of the fluorescent enhancement for small-molecule dyes, the quantum dots and dNTP labeled fluorescence probes, and investigate its associated mechanism of molecular recognition and assembly; 3) To explore the new DNA sequencing workflow rely on these key technique. Our achievement of this project would contribute a new strategy for single-cell DNA sequencing.

单细胞测序在生命科学研究中具有重要意义，但是现阶段的DNA荧光测序技术存在荧光标记物量子产率较低，荧光稳定性不佳，散射光背景干扰较大等不足，导致DNA测序操作繁杂，成本很高，阻碍了单细胞测序技术的发展。因此，建立高灵敏度和低成本的DNA测序新方法，在基础研究和实际应用中都有十分迫切的需求。本项目拟将金属微纳结构引入DNA测序中，利用等离子体激元共振效应实现信号分子的荧光强度大幅增强，为DNA测序提供灵敏度高、程序简单的实施方案。研究内容概括为：1）设计、合成出稳定、有序、可控的由荧光物质（荧光标记dNTP，荧光纳米探针和荧光小分子探针）和金属纳米材料耦合形成的具有等离子体激元共振荧光增强效应的金属微纳结构；2）研究其在等离子共振场中荧光物质的光学性质和与其相关的分子识别与组装机制；3）探索将所建立的方法用于DNA分析的可能性和条件。本项目的研究成果将为DNA测序提供一种新思路。

荧光探针对DNA的分析与测序十分重要。合成新的荧光探针并探索荧光信号增强的方法，是提高DNA检测灵敏度的有效途径。本项目按照任务书的计划在新型纳米荧光探针的设计与合成、等离子体激元共振效应对荧光增强的影响研究、以及DNA和相关化合物分子的高灵敏度检测与测序方面进行了深入研究，取得了以下有创新意义的研究成果：（1）合成了一系列具有金属微纳结构的荧光纳米探针，具有生物相容性好、灵敏度和选择性高的特点；（2）深入研究了等离子体局域电场的产生和激元共振增强荧光效应。通过调谐二氧化硅的厚度控制不同金核壳纳米微结构与染料分子之间的距离，实现了PPi及相关生物分子如microRNA、端粒酶、ATP等的高灵敏度分析，以及DNA单碱基错配放大检测，为DNA检测技术的发展提供了新思路；（3）提出了一种使用比率型聚集诱导荧光（AIE）分子替代普通荧光分子进行边合成边测序的方法，分别将四种AIE分子修饰后的脱氧核苷酸引入到模板链中含有连续20个相同碱基的多循环PCR反应中，在酶切后发生聚集，初步实现了边合成边测序。上述成果为DNA的测序及其高灵敏度检测提供了新的方法和技术。本项目执行期间，发表SCI论文35篇，包括Adv. Funct. Mater.2篇（校对1篇），Anal. Chem. 4篇，Chem. Commun. 2篇，Biosens. Bioelectron. 2篇；已授权发明专利2项；在项目实施期间，培养博士生3名，硕士生4名，圆满完成了本项目的研究目标和研究任务。