石油污染土壤植物修复过程中根际促生菌的强化机制

本项目拟针对我国石油污染土壤大多处于盐碱地这一特点，在前期筛选的耐盐碱高效修复植物和植物根际促生菌（PGPR）基础上，首先利用基因工程手段对试验所获得的PGPR进行绿色荧光蛋白基因标记，并明确其在修复植物根部定殖、扩展、分布规律。然后再通过完善相关根系分泌物收集、鉴定方法，研究PGPR影响下的植物根系生长、分泌物组分变化以及分泌物对石油降解相关微生物生长、降解特性的影响等。随后设计一套针对胜利油田盐碱地石油污染土壤的PGPR强化植物修复实验。研究土壤环境中，在石油、盐碱等胁迫下，PGPR强化植物修复对污染物、根际微生物特别是石油烃降解相关的微生物组成与群落结构的影响，探讨根际微生态变化在强化修复中的作用。从而初步揭示其作用机理，为PGPR强化石油污染土壤的植物修复提供理论依据。

根际促生菌（PGPR）是一类生活在植物根际能够促进植物生长的有益细菌。对于具有修复作用的植物来说，利用PGPR提高胁迫环境下植物的抗逆性有助于进一步提高植物修复的效率。本研究，以1-氨基环丙烷-1羧酸（ACC）为唯一氮源，从石油污染的土壤中分离得到100余株具有ACC脱氨酶活性的菌株，选取其中5株ACC脱氨酶比活力＞1.0 M α-KB mg-1 h-1的菌株进一步研究，发现菌株D5A表现出较强的植物促生性能。通过对其进行生理生化特性和16S rDNA序列分析，该菌株初步鉴定为克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）。Klebsiella sp.D5A在pH范围为4-10的培养基中的均能正常生长，在9%盐浓度的环境下，菌株D5A的OD值仍可达到1.2，说明菌株D5A具有较强的耐酸碱性、耐盐特性。菌株D5A对于盐胁迫条件下修复植物高羊茅的种子发芽以及幼苗生长也具有显著的促进作用。接种处理高羊茅的种子发芽率、芽长和根长，在9g/kg NaCl浓度条件下，分别增加109%, 29% 和54%。为研究分离所得到的根际促生菌D5A对修复植物高羊茅的生长及修复效率的影响。本项目在温室开展了石油污染盐碱土的D5A强化高羊茅修复实验。盆栽试验中结果显示:修复后高羊茅+D5A处理组土壤中总石油烃含量降低了66.4 %，而对照组为51.2 %。接菌处理组的生物量、叶绿素含量及根系活力也显著高于不接菌处理组。该结果表明促生菌D5A不仅能促进高羊茅在石油污染土壤中生长也能提高其生物修复效率。本项目还设计了一套根系分泌物循环收集装置，利用该装置收集并通过GC-MS 鉴定，检测到高羊茅根分泌物中主要有机酸为苯甲酸、硬脂酸、棕榈酸、对羟基苯甲酸等。随后研究了这几种物质对分离得到的植物根际促生菌Klebsiella sp.D5A的化感作用。结果表明，在浓度为10-40 μM的条件下，四种有机酸对D5A菌株的趋化性指数均大于2，趋化效果显著，其中棕榈酸的趋化性效果最好。另外，在有机酸为30 μM时D5A菌的趋化性指数最大。迁移性实验表明苯甲酸及棕榈酸对菌群则产生明显的迁移诱导效果，苯甲酸、棕榈酸处理对应的菌圈直径分别为对照的1.58倍和1.98倍。该研究结果初步揭示了PGPR强化高羊茅修复过程中的根系-微生物的相互作用机理。