中国北方汉族人群COL4A1基因单核苷酸多态性与脑白质疏松风险的研究

IV型胶原蛋白基因α1（α1 type IV collagen，COL4A1）编码IV型胶原的α1链，是构成血管基底膜的主要成分。近年研究发现COL4A1基因突变是脑小血管病的单基因病因，脑小血管病是脑白质疏松的重要病理机制之一。研究证实65岁以上的人群中有1/4存在脑白质疏松，脑白质疏松与认知、精神、步态障碍和尿便障碍关系密切，但其确切病因及发病机制尚未阐明。我们先前的研究证实脑白质疏松患者脑小动脉基底膜IV胶原表达较对照组明显增加。本课题拟采用基因芯片目标区域捕获测序法检测COL4A1基因的SNP位点与脑白质疏松的相关性,分析中国北方汉族人在这些位点的特点,验证IV型胶原蛋白功能，并分析高血压与基因多态交互作用对脑白质疏松风险的影响，为揭示脑白质疏松的生物学机制奠定重要基础，最终设计脑白质疏松筛查基因芯片，为流行病学调查确定脑白质疏松高危人群以及进行患病危险度评价提供相应的标志物。

脑白质疏松的确切病因及发病机制尚未阐明。本课题设计采用目标区域捕获测序法检测COL4A1基因的SNP突变位点对脑白质疏松的致病性，并分析高血压等危险因素与基因多态性交互作用对脑白质疏松的影响，以期为揭示脑白质疏松的生物学机制奠定基础。本研究分两个阶段：第一阶段1）采用NimbleGende的目标区域捕获试剂盒完成了40名脑白质疏松患者和8名正常人的COL4A1基因捕获，捕获的区域包括COL4A1基因所覆盖的约160-kb区域和该基因两侧各100-kb的基因间区。NimbleGen对着约360-kb的捕获效率达81.2%，其中COL4A1的coding区的覆盖度达100%。2）采用Illumina Hiseg2000测序仪对所有样本进行二代测序研究。3）生物信息学分析：我们在48个样本中找到841个SNP和56个插入/缺失。之后我们对检测到3个错义突变位点进行了危害度评估，发现该3个位点对蛋白危害度为中性，对这3个位点在已有的数据库进行探索后发现该3个位点已知的常见变异。因此排除了COL4A1基因和我国脑白质疏松之间的关联。本阶段同时我们利用脑白质疏松病例资料对其危险因素和临床意义进行了研究，发表论著中文核心期刊5篇，SCI收录论著1篇。第二个阶段：基于前期研究结果，我们扩展本研究的内容，挑选了表型一致且遗传风险因素较高的脑白质疏松患者11例（经费所限），采用Illumina推荐的建库和测序流程，完成了这些样本全基因组测序工作。我们使用BWA、Samtools、GATK完成样本的拼接和变异位点获取，最终获得了9,935,469个变异位点。经过标准筛选后，最后得出8个候选变异位点，分别位于6个基因（MTFHR, FA2H, GFAP, ANGPTL4, NOTCH3, and ABCD1）上。通过sequenom的方法在更大的样本量中进行验证，我们挑选了8个候选变异位点和GWAS研究中的16个标记的基因。在384份样本中开展了验证工作，发现NOTCH3, p.G1295R and MTHFR, p.V221M两个变异位点只存在于脑白质疏松组中,提示NOTCH3为我国脑白质疏松的致病基因。通过预测，发现的两个位点NOTCH3, p.G1295R and MTHFR, p.V221M均为蛋白结构的有害位点，提示此两个位点可能是我国脑白质疏松的致病突变。本研究成果已成文待发表