miR-204促进间充质干细胞向成骨细胞分化的机制研究

成骨细胞由多向分化潜能的间充质细胞分化而来，WNT信号在这一过程发挥重要作用。microRNA是与成骨细胞分化密切相关的分子，我们的研究也发现，miR-204在成骨细胞分化中上调，且miR-204的过表达促进了成骨细胞的分化。本项目预测GSK3β是miR-204的靶基因，生物信息学显示miR-204靶向于GSK3β的3'-UTR。然后，应用细胞学实验证明miR-204抑制GSK3β-3'-UTR表达,miR-204是否下调GSK3β的蛋白表达。接着，考察miR-204下调GSK3β表达是否破坏'Axin-APC-GSK3β'复合体、激活WNT信号。最后，研究WNT的活化是否诱导β-catenin的胞内聚集和核转移，激活成骨细胞分化所必需的转录因子TCF/LEF，从而表达成骨细胞分化中所需Runx2基因等。证实miR-204在成骨细胞的分化中的作用，将为防治骨质疏松等病症的发生发挥重要作用。

由于正式实验与预实验结果有较大偏差，经过对课题重新设计，围绕miRNA对Wnt通路及成骨分化的调控，结合Eskildse等的芯片结果，选择miR-101进行后续研究：①hBMSCs培养于成骨分化培养基，显示成骨标志物表达明显上调，细胞矿化明显增加；荧光定量PCR检测BMSCs成骨分化过程中miR-101的表达，表明miR-101可能在BMSCs成骨分化过程中发挥调控作用。②构建过表达miR-101的慢病毒，感染BMSCs并获得稳定表达miR-101的细胞，利用anti-miR-101转染BMSCs后下调内源性miR-101的表达。miR-101的表达与成骨相关基因的表达、碱性磷酸酶活性及细胞矿化程度均呈正相关。表明miR-101对成骨分化起到正向调控作用。③利用在线软件分析，发现EZH2是miR-101的潜在靶基因；Western blot和荧光定量PCR检测显示，miR-101过表达细胞中EZH2的表达水平明显减低，而内源性miR-101干扰细胞中EZH2的表达水平显著增加。表明miR-101通过与EZH2 3’UTR直接作用实现对EZH2的负向调控。④实验表明外源性EZH2过表达明显抑制了因miR-101过表达引起的成骨相关基因的表达上升，同时明显降低了ALP活性和矿化水平；另一方面，EZH2 siRNA消除了anti-miR-101对成骨分化的负向调节作用。这些结果表明，miR-101对成骨分化的正向调控是通过下调EZH2的表达实现的。⑤分析miR-101过表达对β-catenin及下游分子的影响，结果显示：miR-101过表达未改变总β-catenin的表达变化，却明显增加了其活性形式β-catenin*的表达；同时明显增加了TOPflash活性，表明Wnt通路激活；β-catenin下游分子（c-Myc、CyclinD1、TCF-1和LEF-1）的表达水平也明显增加；ICG-001（β-catenin活化抑制剂）抑制miR-101过表达细胞成骨分化过程中ALP的活性增加，并抑制miR-101过表达细胞Wnt信号通路TOPFlash/FOPFlash的增加。这些结果表明Wnt通路在miR-101调控成骨分化过程中发挥重要的作用。综合结果：miR-101靶向EZH2和Wnt信号通路促进间充质干细胞成骨分化。