癌/睾丸抗原HCA587/MAGE-C2特异TCR基因修饰T细胞的建立及其抗肿瘤作用研究

Adoptive cellular immunotherapy (ACT) is a promising cancer therapy, and it has been successful in achieving tumor regression in melanoma and hematologic malignancies. However, the application of this immunotherapy approach to other types of cancer is limited by the difficulty in identifying tumor specific antigens. HCA587 (also known as MAGE-C2) was identified by serological analysis of recombinant cDNA expression library from heptocellular carcinoma in our laboratory. It is not expressed in normal tissues except testis, but widely expressed in various cancers. Thus it has been considered as an ideal candidate target for specific immunotherapy. In our previous study, we identified HLA-A*0201 restricted epitopes of HCA587/MAGE-C2 using "reverse immunology" assay, and the peptide 248-256 derived from HCA587/MAGE-C2 was found to induce strong cellular immune responses in HLA-A*0201 transgenic mice. Based on our previous results, we are going to identify HCA587/MAGE-C2-specific and HLA-A*0201-restricted TCRs, establish genetically modified T cells with TCRs that recognize the HCA587/MAGE-C2: 248-256 peptide in the context of A*0201, and evaluate the antitumor effects of the modified T cells in mice model. Our study will support the application of HCA587/MAGE-C2 TCR-engineered T cells in the treatment of human cancer patients.

过继细胞治疗在恶性黑色素瘤及血液系统恶性肿瘤患者的临床试验中取得了良好疗效，但由于缺乏肿瘤特异抗原作为靶点，限制了该方法在其他类型肿瘤治疗中的应用。 HCA587/MAGE-C2是我室鉴定的一个癌/睾丸抗原，由于其在正常组织中仅局限表达于睾丸，而在多种肿瘤组织中广泛表达，被认为是肿瘤免疫治疗的理想候选分子。我们前期通过“逆向免疫学”的方法对HCA587分子中的HLA-A*0201限制性MHCI类抗原表位进行了鉴定，并利用HLA-A*0201转基因小鼠证明了p248-256表位肽能在小鼠体内诱导强烈的抗原特异的细胞免疫应答。本课题拟在前期研究的基础上，克隆鉴定特异识别p248-256表位肽的TCR编码基因，制备HCA587特异TCR基因修饰的人T细胞，研究其在动物模型中的抗肿瘤效果并对其机制进行初步探索，为HCA587特异TCR基因修饰的人T细胞应用于临床肿瘤患者的治疗提供可靠的实验依据。

T细胞受体改造的T细胞 (TCR-T) 疗法是目前肿瘤免疫治疗的重要手段之一。近年来一些临床试验显示，TCR-T细胞疗法在治疗多种类型的实体瘤中显示了较好的疗效，在未来肿瘤治疗领域中具有很大的发展潜力。但是目前的临床治疗中有效靶点较少，大大限制了该疗法的使用范围。HCA587是我室利用SEREX方法从肝癌患者的重组cDNA文库中鉴定出的一种癌/睾丸抗原，国际命名为黑色素瘤相关抗原-C2 (MAGEC2)。该抗原在正常组织中局限表达于“免疫豁免器官”睾丸，但在多种肿瘤组织中高表达。我们前期研究证明了HCA587/MAGEC2在体内具有很强的免疫原性，其长肽疫苗和蛋白疫苗在荷瘤小鼠模型中都显示了良好的抗肿瘤效果，是肿瘤免疫治疗的理想候选靶点。我们通过“逆向免疫学”方法结合体内外生物学实验验证，筛选出HCA587/MAGEC2表位肽（简称p1）可诱导强烈的抗原特异的细胞免疫应答，利用该表位肽免疫HLA-A*0201转基因小鼠获得能识别HCA587/MAGEC2的特异T细胞，经体外与负载表位肽的树突状细胞共同孵育，建立了HCA587/MAGEC2抗原特异反应的小鼠T细胞系。利用流式细胞仪分选CD8和p1 Pentamer双阳性细胞获得特异识别表位肽p1的T细胞群体，进一步通过5’RACE-PCR方法获得TCR α链和β链的可变区编码基因片段，将目的基因片段与pRACE克隆载体连接、转化，从α链样本中挑取60个、β链样本中挑取156个单克隆菌落提取质粒进行酶切鉴定，从中得到43个含α链编码基因和98个含β链编码基因的质粒进行测序分析，获得可变区富集序列并进行人工合成。将合成的含有α链和β链的编码基因序列克隆至慢病毒表达载体，转染HEK-293T细胞进行慢病毒的包装，病毒经浓缩后感染人外周血T淋巴细胞，通过流式细胞仪分析可检测到识别HCA587/MAGEC2表位肽p1的TCR在CD8+ T细胞表面的表达，体外及体内的初步实验结果提示特异识别HCA587/MAGEC2抗原表位肽p1的TCR-T细胞具有较好的抗肿瘤生物学活性。本研究为将来应用于HCA587/MAGEC2阳性肿瘤患者的过继细胞免疫治疗奠定了基础。