基于NKG2D-ULBPs失衡探讨TGF-β诱导急性髓系白血病细胞逃逸Vγ9Vδ2T细胞免疫杀伤的作用及机制

Vγ9Vδ2T cells, the major γδT-cell subset, display a great anti-tumor activity. We previously reported that ex vivo-expanded Vγ9Vδ2T cells could efficiently kill human acute myeloid leukemia cells(AML). However, some immune escape mechanisms protect AML cells from Vγ9Vδ2T attack in vivo, and the transforming growth factor-β (TGF-β) plays a important role in the immune evasion. We found that the addition of TGF-β inhibited Vγ9Vδ2T activation and protect AML cells from killing by Vγ9Vδ2T. Also, the interactions of NKG2D recptor with its ligand ULBPs was necessary in the process of recognizing and killing AML cells by Vγ9Vδ2T; and TGF-β significantly reduced the expression of ULBP1 and ULBP4 in the AML cells. Based on the study above, we hypothesize that TGF-β could protect AML cells from Vγ9Vδ2T attack by inhibiting the interaction of NKG2D-ULBPs. In this project, we will use small molecular inhibitors and RNAi to block of TGF-β/Smads and non-Smads signals，define the effect of down-regulation of NKG2D-ULBPs by TGF-βthrough Smads or non-Smads pathways，and further explore the mechanism of TGF-βinduced shedding of ULBPs by modulating metalloproteinases. This project will not only enrich the understanding of the biological behavior of Vγ9Vδ2T cells, but also develop a new target to conquer immune evasion for AML immunotherapy.

Vγ9Vδ2T(γδT)细胞具强大的肿瘤杀伤活性，我们前期报道"体外γδT可有效杀伤AML细胞"，但体内AML往往通过多种机制逃避γδT的免疫杀伤，免疫抑制因子TGF-β在AML的免疫逃逸过程中发挥重要作用。我们发现外源性TGF-β能抑制γδT活化及介导AML逃避免疫杀伤；同时发现γδT杀伤AML的关键是NKG2D与其配体ULBPs识别，TGF-β则显著抑制AML细胞ULBP1和ULBP4表达。因此，推论TGF-β可能通过抑制NKG2D-ULBPs来诱导AML逃避γδT的免疫杀伤。项目应用小分子抑制剂及基因敲除技术，靶向沉默TGF-β/Smads及非Smad通路，明确TGF-β通过Smads或非Smads通路调节NKG2D-ULBPs的作用，探索TGF-β降解ULBPs的机制。全面阐明TGF-β及其下游对γδT识别杀伤AML的负向调控机制，为γδT临床治疗AML、克服免疫逃逸奠定理论基础。

Vγ9Vδ2T(γδT)细胞具强大的肿瘤杀伤活性，体外γδT可有效杀伤AML细胞株和原代细胞，但体内AML往往通过多种机制逃避γδT的免疫杀伤，免疫抑制因子TGF-β在AML的免疫逃逸过程中发挥重要作用。我们采用外源性TGF-β预处理AML细胞株KS-1细胞，虽然致使KS-1细胞表面的杀伤受体NKG2D的配体如ULBP2/5/6均下降，对MICA/B表达影响小，但并不能减弱KS-1细胞被γδT杀伤的效应；同样采用TGF-β预处理另一个AML细胞株K562也不能减弱K562被γδT杀伤的效应。然而，从另一方面，采用TGF-β预处理γδT后，可显著抑制γδT对AML细胞株KS-1的杀伤效率，而对NB4杀伤效率影响不大；我们进一步检测发现，TGF-β明显减弱了γδT细胞表面杀伤受体CD226的表达，而对于高表达CD266的配体（Nectin-2）的KS-1细胞杀伤抑制作用最强，对低表达Nectin-2的HL-60细胞杀伤抑制作用弱。我们进一步采用CD226抗体阻断γδT的杀伤受体CD226信号，同样可以发现γδT的杀伤效应减弱。并且我们采取western检测发现γδT与KS-1同培养后，γδT的ERK磷酸化水平增高，而γδT与HL60共培养，对γδT未见ERK磷酸化。TGF-β处理γδT，可以抑制γδT的ERK磷酸化。提示TGF-β可能通过抑制γδT的CD266表达，进而导致γδT胞内的ERK磷酸化水平下降，进而影响到γδT的杀伤能力。综上，TGF-β通过调控CD226-Nectin-2轴影响γδT的ERK信号通路，进而发挥免疫抑制作用。同时，项目进一步发现，γδT细胞杀伤白血病细胞的效应可通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂获得提高，并且不会影响免疫调节功能，Notch信号通路参与组蛋白去乙酰化酶抑制剂对γδT细胞的调控作用，研究其具体机制为将来血液系统恶性疾病的免疫治疗提供新策略。