白血病细胞通过自噬调控ULBP4逃逸γ9δ2T细胞免疫杀伤的作用及机制研究

γδT cell is powerful in killing various tumor cells，but some immune escape mechanisms protect leukemia cells from γδT attack in vivo, which limits γδT clinical application. Recently, autophagy has become a hot spot in the field of biological research. It is very clear that autophagy is envolved in tumorigenesis, metastasis and drug resistance, however, it is unknown whether autophagy plays a role in the process of leukemia cells evading γδT-mediated killing. Our previous study have revealed that ULBP4 on leukemia cell is determinant of recognition and killing by γδTcell. We also found that inhibition of autophagy can enhance leukemia cell susceptibility to γδT-mediated lysis in vitro, and meanwhile increase the expression level of ULBP4. These findings indicates that leukemia cells evade effective γδT-mediated killing by activating autophagy. This study will use siRNA-ATG5/ATG12 or drugs to block leukemia cell autophagy, and observe the killing effect of γδT, both in vivo and in vitro; clariy the post-transcriptional regulation mechanism of ULBP4 protein by autophagy lysosomal system, such as direct lysis , inhibition of translocation to the cell membrane, or inducing sULBP production, via electron microscopy, immunofluorescence, immuno co-precipitation; try to seek an efficient way to sensitize leukemia to γδT cell, and provide evidence that targeting autophagy may pave the way to achieve more effective γδT-based anti-leukemia immunotherapy.

γδT细胞具良好的肿瘤杀伤能力，但白血病细胞往往通过免疫逃逸机制逃避γδT的免疫攻击，限制其临床应用。近年来自噬成为生物学领域研究热点，对肿瘤发生、耐药、转移的调控作用较为明确，自噬是否在白血病逃逸γδT杀伤过程中发挥作用尚无研究。本项目立足前期成果“γδT杀伤白血病细胞的关键是白血病细胞ULBP4的表达以及NKG2D-ULBP4的识别”，发现抑制白血病细胞自噬促进了γδT对其免疫清除，同时诱导了胞膜ULBP4的表达，推测白血病细胞可能通过自噬调控ULBP4而逃逸γδT的杀伤。项目在细胞及动物水平上，通过siRNA干扰ATG5/ATG12或采用药物阻断白血病细胞自噬，观察γδT对其杀伤作用；通过电镜、免疫荧光、免疫共沉淀等技术分析自噬-溶酶体系统对ULBP4蛋白的转录后调控机制（直接降解、抑制向胞膜转运、或sULBP产生）及信号通路；为提高γδT杀伤效率，推动γδT的临床应用提供实验依据。

自噬参与了肿瘤细胞的发生、转移、耐药等诸病理过程，是肿瘤细胞应对压力环境及保证细胞能量供给的重要手段。抑制肿瘤细胞自噬极具抗肿瘤潜能，近年来自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)在抗肿瘤治疗中的作用备受关注。HCQ通过“靶向自噬”不仅可以提高多种药物的抗肿瘤作用，还可以有效促进肿瘤的免疫清除。抑制低氧诱导的自噬可以提高肺癌细胞对 NK 细胞杀伤作用的敏感性。Vγ9Vδ2T细胞是一种极具应用潜力的固有免疫样淋巴细胞，很多体内和体外研究都证实了Vγ9Vδ2T细胞可以有效杀伤多种白血病细胞，是细胞免疫治疗的 “明日之星”。我们的研究发现HCQ 可以有效阻断 K562/GO1 细胞(人 CML 伊马替尼耐药株)和 K562 细胞(人 CML 伊马替尼敏感株)自噬，增强了CML细胞内LC3II和 P62的表达。并且HCQ增强了 K562/GO1和K562细胞对Vγ9Vδ2T杀伤作用的敏感性，在效靶比为20：1情况下从35.9%上升到47.1%,在10:1下从18.72%上升到24.95%。但敲降ATG7蛋白阻断细胞自噬并不能模拟HCQ的增敏作用，即使在ATG7敲降的 K562/GO1 和 K562 细胞中HCQ依旧可以提高Vγ9Vδ2 T对肿瘤细胞的杀伤作用，提示HCQ的增敏作用并不依赖于抑制肿瘤细胞自噬。我们发现HCQ诱导了 ULBP4（一种 NKG2DL）在 K562/GO1和 K562细胞膜表达，并且阻断NKG2D 与 NKG2DL的相互识别后HCQ的增敏作用几乎消失，提示诱导ULBP4在CML细胞表面表达是HCQ促进Vγ9Vδ2T杀伤CML细胞的关键。通过进一步研究发现了HCQ并没有提高 ULBP4 的转录及合成，而是诱导细胞内潴留的 ULBP4转移到细胞膜，进而促进 Vγ9Vδ2T细胞对CML细胞的识别和杀伤。本研究为 HCQ 联合 Vγ9Vδ2T细胞在CML的细胞治疗中的应用奠定研究基础。