干细胞调控基因WUSCHEL在杂交鹅掌楸体胚发生中的作用研究

体细胞胚胎发生是木本植物快速高效繁殖的重要手段，了解体胚发生机理就能从细胞、分子水平对体胚发生进行调控，因此研究体胚发生的机理尤为重要。本研究以干细胞调控基因WUS为切入点，以杂交鹅掌楸同步化体胚发生体系为材料，通过同源克隆获得木本植物来源的WUS，利用拟南芥的完全丧失功能的突变体wus-1进行基因拯救试验研究杂交鹅掌楸WUS基因功能；利用35S：WUS-GR转化拟野生型拟南芥，以转化材料建立体胚发生体系，研究WUS基因表达对拟南芥体胚发生能力的影响；通过RNA原位杂交和实时荧光定量PCR研究WUS在杂交鹅掌楸体胚发生过程中的时空表达，推测WUS在杂交鹅掌楸体胚发生中的作用；最后分别利用拟南芥和杂交鹅掌楸来源的WUS构建35S：WUS-GR表达载体转化杂交鹅掌楸培养细胞和花器管，分析WUS基因的诱导表达与木本植物体胚发生能力的关系，研究WUS基因在木本植物体胚发生中的功能。

本项目以杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系为材料，进行了转录组测序和干细胞调控基因的分子克隆及表达分析，建立了杂交鹅掌楸单细胞起源的遗传转化体系，对克隆的基因进行了初步的遗传转化。. 在研究中首先通过悬浮培养和分级筛选的方法建立了同步化发生的体胚发生体系，利用杂交鹅掌楸各个发育时期的体细胞胚进行了转录组测序，进行了序列的拼装和生物信息学分析；获得了干细胞调控基因WUS基因家族WOX系列基因，进行了基因结构分析，构建了植物表达载体，利用拟南芥为材料进行了功能验证；以杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系为材料，通过实时荧光定量PCR技术研究基因表达情况，推测各个基因在体胚发生中的功能,研究发现WOX2基因与体胚发生密切相关，WOX5与根及茎的发育相关；以GUS基因为报告建立了杂交鹅掌楸单细胞起源的遗传转化体系，以杂交鹅掌楸胚性细胞为材料，利用WOX2基因进行单细胞的遗传转化，探索其在林木体胚发生中的作用。为配合项目研究，深入了解植物干细胞基因调控网络，本研究还以拟南芥为材料，筛选到茎尖分生组织标记基因CLV3异常表达突变体2-132（AP2）和1-64（AGO1）。表达分析表明两个突变体中的WUS基因表达也发生了异常，说明AP2和AGO1均参与WUS的表达调控。现已获得杂交鹅掌楸LhAP2并构建植物表达载体，利用拟南芥进行功能验证。. 在项目计划的资助下，共发表论文10篇，其中SCI论文4篇，中文论文6篇（包括接受发表2篇），培养硕士研究生6名，其中3名已毕业，在读3名；培养博士研究生2名。