BMSCs源性外泌体调控巨噬细胞IL-10/STAT3自分泌环路促进腱-骨愈合的作用及机制研究

Poor tendon-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction is one of problems to be solved urgently and main factors that affect graft long-term surgical effects. Our previous studies showed excessive aseptic inflammation due to macrophage polarization toward the M1 phenotype in the early stage of healing to be an important cause of poor tendon-bone healing, and anti-inflammatory M2 macrophages promote this healing. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were recently shown to regulate macrophages to exert anti-inflammatory effects, but the specific mechanisms require further study. Our preliminary experiments have found that exosomes secreted by BMSCs contain active signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) protein, which plays an important signaling role in the interleukin-10 (IL-10) autocrine loop in macrophages and regulates macrophage polarization toward the M2 phenotype. Thus, we speculate that the exosomes may possess potential activity of promoting tendon-bone healing. In this study, using RNA interference, molecular biological and immunological techniques, we will identify the anti-inflammatory mechanism by which active STAT3 contained in BMSC-derived exosomes regulates M2 macrophage polarization. Using an animal model, fluorescent tracer, and biological chip, the effects of these exosomes on promoting tendon-bone healing will be verified. The project is expected to provide a new idea and a new theoretical basis for promoting tendon-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction.

前交叉韧带重建术后腱-骨愈合不良是影响远期手术效果的关键因素和亟待解决的问题之一。我们已研究证实，术后早期M1型巨噬细胞产生的过度炎症反应是导致腱-骨愈合不良的重要病理因素，而抗炎性M2型巨噬细胞有助于促进腱-骨愈合。近来已知，骨髓间充质干细胞（BMSCs）可调控巨噬细胞发挥抗炎作用，但其具体机制仍有待探索。我们的预实验发现，BMSCs分泌的外泌体中含有活化STAT3蛋白，而STAT3信号在巨噬细胞IL-10自分泌环路中起重要作用，可调控M2型巨噬细胞极化，故我们推测该外泌体具有促进腱-骨愈合的潜在活性。据此，本研究拟采用RNA干扰、分子生物和免疫学等技术，明确BMSCs源性外泌体所含活化STAT3调控M2型巨噬细胞极化，发挥抗炎作用的机制；通过构建动物模型，采用荧光示踪、生物芯片等技术，验证该外泌体促进腱-骨愈合的作用。本课题有望为促进前交叉韧带重建术后腱-骨愈合提供新的思路和理论依据。

前交叉韧带（ACL）重建术后腱-骨愈合不良是影响远期手术效果的关键因素和亟待解决的问题之一。我们研究证实，术后早期过度的炎症反应是导致腱-骨愈合不良的重要病理因素。近来已知，骨髓间充质干细胞（BMSCs）可以发挥抗炎作用，但其具体机制仍有待探索，可能与其分泌的外泌体有关。因此，本课题通过提取的BMSCs源性外泌体（BMSC-EVs）进行干预，观察其对巨噬细胞的影响，明确BMSC-EVs调控炎症反应的效果。探索BMSC-EVs中的活化STAT3蛋白（p-STAT3）及其相关通路在调控巨噬细胞极化和发挥抗炎作用中的机制。通过构建大鼠ACL重建动物模型，进一步验证BMSC-EVs在动物体内的抗炎和潜在的改善腱-骨愈合的作用。. 本课题成功证实BMSC-EVs内含有较丰富的p-STAT3。通过对外泌体进行荧光示踪可见，BMSC-EVs可以被巨噬细胞摄取，并可以导致巨噬细胞内的p-STAT含量增加。BMSC-EVs可以调控巨噬细胞向M2型极化，增强M2型相关基因的表达。同时，BMSC-EVs还可以抑制M1型巨噬细胞极化及其相关基因的表达。此外，我们发现BMSC-EVs可使巨噬细胞环境中的IL-10含量增加，而IL-10是调控巨噬细胞极化的关键因子之一，且该作用被我们证实与BMSC-EVs中富含的p-STAT3激活IL-10/STAT3信号通路有关。体内实验成功构建大鼠ACL重建动物模型，并用BMSC-EVs进行干预。虽然BMSC-EVs的干预对各时间点移植物生物力学无明显影响，但其可以有效改善ACL重建术后膝关节微环境中的炎症状态。8周时可见BMSC-Evs组中ACL重建的骨隧道无明显扩大，对移植物周围骨量有很好的保护作用。组织切片显示，BMSC-EVs的干预可使腱-骨愈合的区域和腱-骨有效接合面积增加，同时减少移植物中炎症细胞的浸润。免疫组化证实，BMSC-EVs不仅可以抑制组织中IL-6等炎症因子的表达，还可以提高抗炎因子IL-10的表达。对巨噬细胞进行标记后发现，BMSC-EVs组的组织中M2型巨噬细表达增加，并有效抑制M1型巨噬细胞的极化和浸润。上述现象在抑制外泌体中p-STAT3的表达后，均不同程度减弱，进一步证实BMSC-EVs中的p-STAT3同样在体内发挥重要作用。本研究的发现有望为改善ACL重建术后腱-骨愈合提供新的思路和理论依据。