中国碳青霉烯不敏感大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的流行病学和耐药机制

碳青霉烯类药物是治疗革兰阴性杆菌感染特别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的最强效β內酰胺类药物。一旦碳青霉烯类药物耐药，临床治疗此类菌株感染将面临极大困难。目前美国、欧洲和中国部分地区已出现碳青霉烯不敏感的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌暴发流行，因此全面了解此类耐药菌的临床流行病学、分子流行病学和耐药机制已刻不容缓。本课题拟收集全国不同地区的16家教学医院2004-2011年分离到的碳青霉烯不敏感大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，通过病例对照研究分析此类耐药菌感染的危险因素和预后状况；通过Diversilab分型系统和MLST技术分析菌株的分子流行病学；通过多种分子生物学技术分析碳青霉烯酶、外膜蛋白缺失以及marR突变对该类菌株碳青霉烯耐药性的影响；最终完整阐述中国碳青霉烯不敏感大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的流行病学和耐药机制，为临床预防和治疗此类菌株感染提供理论依据，并对此类菌株的院内感染控制提供理论依据。

[摘要] 目的：研究碳青酶烯耐药肠杆菌科菌的感染危险因素、临床预后、分子流行病学以及耐药机制。方法 收集2004-2012年我国34家教学医院的342株碳青霉烯耐药肠杆菌科菌，采用病例-对照研究分析碳青霉烯耐药肠杆菌科菌感染的危险因素和临床预后。采用对倍琼脂稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度；采用改良的Hodge试验和EDTA协同试验检测菌株产的碳青霉烯酶；接合试验检测耐药基因的可移动性；质粒提取试验分析菌株携带的质粒；Southern杂交进行碳青霉烯酶基因定位；全质粒序列测序和分析进行碳青霉烯酶基因环境研究；聚合酶链式反应（PCR）检测包括碳青霉烯酶基因在内的多种β内酰胺酶基因和整合子基因；对PCR阳性产物进行序列测定以确定基因型别；十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析菌株的外膜孔通道蛋白。多位点序列分析（MLST）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析CRE的同源性。采用基因克隆技术研究marR突变对大肠埃希菌碳青霉烯耐药的影响。 结果：CRE感染的临床治疗失败率70.59%。基础病史有肺部疾病以及在ICU发生感染是独立的危险因素。CRE敏感性较高的药物包括多粘菌素B（96.1%），替加环素（84.2%）和阿米卡星（55.5%）。342株CRE菌株中241株（70.5%）携带碳青霉烯酶基因，其中171株携带blaKPC-2基因。产KPC-2酶的CRE菌株主要分布于浙江省、北京市和江苏省。多位点序列分析发现152株产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌中105株（69.1%）为ST11型。不同的碳青霉烯酶基因经Southern杂交证实位于不同大小的质粒上。全质粒测序的结果显示转座子、插入序列以及整合子等多种可移动元件在碳青霉烯酶基因的传播中扮演重要作用。外膜蛋白分析显示外膜蛋白缺失为不产碳青霉烯酶CRE的主要耐药机制。MarR突变分析研究显示MarR的Gln42Arg突变可引起MarR功能失活，从而提升大肠埃希菌对碳青霉烯类药物的耐药性。结论：本研究是一项全国多中心的连续9年CRE流行病学和耐药机制研究，阐明了CRE感染的高治疗失败率和危险因素。分子流行病学显示产碳青霉烯酶菌株是主要的CRE类型，且ST11型为中国主流的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌克隆型。产碳青酶烯酶、外膜蛋白缺失在CRE耐药机制中起主要作用，marR基因突变在大肠埃希菌中能导致碳青霉烯耐药。