钙网蛋白（CRT）介导的内质网应激在应力诱导成肌细胞凋亡中的作用及其调控机制

我们已经证明：功能矫形治疗中应力诱导成肌细胞凋亡时不依赖经典的Fas/FasL凋亡途径。那么，应力诱导成肌细胞凋亡的分子机制是什么？进一步研究显示：应力作用下成肌细胞内质网应激(ERs)反应性凋亡的关键分子Caspase－12和特异的促凋亡转录因子GADD153表达均上调。最近动物实验证实：功能矫形力促进大鼠翼外肌CRT过表达；并通过Bax和Bcl-2途径促进成肌细胞凋亡。由此，我们提出以下假设：功能矫形治疗中张应力触发严重内质网应激，破坏细胞Ca2＋稳态、诱发ERs相关性细胞凋亡。本项目拟进一步采用基因转染、基因过表达、RNA干扰等技术，旨在获得钙网蛋白介导的内质网应激参与应力诱导成肌细胞凋亡的可靠证据，并阐明其信号转导和调控机制；明确应力、CRT介导的内质网应激、成肌细胞凋亡三者的关系。本项目有望揭示应力调控成肌细胞凋亡的新机制，为阐明功能矫形治疗的细胞及分子机理提供新思路和实验依据。

在细胞凋亡的信号通路研究中，内质网应激介导的细胞信号凋亡通路是一个新的发现。内质网应激的表现包括钙稳态的失衡，钙网蛋白（CRT），蛋白折叠酶及凋亡因子的活化，其中钙网蛋白表达的升高也是内质网应激的标志之一。但钙网蛋白在介导细胞凋亡中的作用一直具有争议，考虑这与不同的刺激因素及细胞类型有关。本项目研究目的为探讨周期性张应力刺激下钙网蛋白与细胞凋亡的关系及信号转导机制，为将来以基因为靶点矫治错颌畸形提供理论支持。本项目在.建立成肌细胞体外培养应力刺激模型的基础上，细胞牵张加力仪对所培养的细胞分别加力0h、1h、6h、12h和24h的周期性张应力，采用hochest染色，及流式细胞术检测细胞在刺激因素下的变化，并利用RT-PCR检测钙网蛋白mRNA的表达变化，同时利用蛋白免疫印迹检测钙网蛋白在蛋白水平的表达，最后采用Fluo-3/AM检测钙离子浓度及利用相应试剂盒检测相关酶的活性变化。研究结果发现:（1）随着加力时间的延长，细胞形态发生变化，细胞凋亡随着加力时间而增加，加力6小时后细胞出现明显的凋亡（p＜0.01）。（2）周期性张应力刺激下CRT mRNA及蛋白表达随着细胞凋亡的增加表达量增多，12h最为明显（p＜0.01）。（3）在应力刺激下细胞中胞浆Ca2＋浓度比不加力组明显升高(p＜0.05)。（4）CRT的表达量与Ca2＋-ATP ase呈负相关（r=-0.74），CRT的mRNA的表达与Ca2＋浓度呈正相关（r=0.87）且与CaN呈正相关相关系数为（r=0.94）。本课题研究结果提示：（1）持续的周期性张应力可促进成肌细胞凋亡，且存在时间相关性。（2）在持续的周期性张应力刺激下CRT表达增加，而且胞浆Ca2＋浓度升高。(3) 结合CRT在细胞凋亡中的作用，我们推测CRT可能通过上调Ca2＋-ATPase的活性，使细胞内钙超载促进成肌细胞的凋亡，但是否为介导细胞凋亡的关键仍需要进一步研究。本课题探讨了CRT在应力刺激下对细胞凋亡的影响，为细胞凋亡通路的彻底阐明奠定基础，进而为以后临床正畸功能矫形治疗的优化和改进提供理论依据