雷公藤甲素抑制血管生成的靶点鉴定及相关信号通路研究

Triptolide, a natural product isolated from Chinese medicinal herb Lei Gong Teng (Tripterygium wilfordii Hook. F.), has potent anti-angiogenesis, antitumor, anti-inflammatory, immunosuppressive and anti-fertility activities. However, most of the direct biological targets binding to triptolide have not been reported yet and the mechanism of actions of triptolide remains to be elucidated. Our previous work discovered that eukaryotic elongation factor 2 (eEF2) was the specific binding protein of triptolide that negatively regulate angiogenesis by screening more than 150 synthesized triptolide related compounds. In this proposal, we will first identify the function group of triptolide contributed to the binding of eEF2 and the residues or domains of eEF2 related to the direct binding of triptolide by mass spectrometry assay. Then we will further identify the downstream signaling pathway after eEF2 binding to triptolide by molecular biology, biochemistry and signal transduction methods, especially the pathway related to the negative regulation of angiogenic VEGFR2 and Tie2 proteins. The goal of this proposal is to develop novel specific anti-angiogenic lead compound with low cytotoxicity based on the better understanding of triptolide's structure-function relationship.

雷公藤甲素及其结构类似物是传统中药雷公藤的主要有效成分，具有强烈的抑制血管生成、抗癌，抗炎和免疫调节等多种药理作用，但是与其直接作用的大部分生物靶点仍不明确，涉及的信号通路也不清楚。我们的前期研究通过血管内皮细胞筛选系统检测了有机合成的150多个雷公藤甲素的结构类似物，发现真核细胞延伸因子2（eEF2）与雷公藤甲素直接相互作用，可能是其特异抑制血管生成的靶点。本项目拟首先通过质谱等方法鉴定雷公藤甲素结合eEF2的具体官能团及eEF2参与结合的具体残基或结构域，利用我们已建立的分子、生化及细胞信号转导研究领域手段，进一步鉴定所影响的下游信号通路，特别是两者结合后负调控VEGFR2和Tie2等血管生成效应分子的机理，最终阐明雷公藤甲素抑制血管生成的信号转导途径，并明确雷公藤甲素各活性区域的结构-功能关系，为开发以雷公藤甲素为基础的新型低毒高专一性抑制血管生成的小分子先导化合物奠定基础。

雷公藤甲素及其结构类似物是传统中药雷公藤的主要有效成分，具有强烈的抑制血管生成、抗癌，抗炎和免疫调节等多种药理作用，但是与其直接作用的大部分生物靶点仍不明确，涉及的信号通路也不清楚。本项目鉴定了一系列直接与雷公藤甲素及其结构类似物相互作用的靶蛋白，并在此基础上明确它们之间相互作用的分子机理。.通过本项目的实施，我们首先鉴定了一系列与雷公藤甲素、雷公藤羰内酯、雷公藤红素等特异结合的分子靶点，并选取了几个重要的靶点进行了机理研究，发现硫氧还蛋白与雷公藤甲素及其结构类似物的结合为共价相互作用，涉及到半胱氨酸残基，通过点突变、质谱分析和酶活检测等，发现其作用位点主要为Cys83和Cys173，并最终影响其分子伴侣活性而发挥其功能。我们还鉴定了谷胱甘肽巯基转移酶也是雷公藤红素等的直接作用靶点，得到了GSTP1与雷公藤红素的共晶，通过分子动力学方法模拟进行了结合位点验证，通过微量热泳动MST测定了一系列GST突变体与其相互作用的亲和力，明确了影响其结合的重要残基。雷公藤红素与GST的直接结合可在脂肪生成过程中定向诱导褐色化转化，相关结果为开发新的肥胖治疗方法提供了先导小分子化合物。.在本项目实施过程中，我们进一步建立了成熟的小分子化合物-蛋白质靶点相互作用鉴定及验证平台，并将其拓展至神经退行性疾病的小分子检测及治疗的分子机制。特别是神经退行性疾病相关毒性蛋白的痕量检测及小分子抑制相关蛋白质聚集及原纤化的分子机理。.我们还建立了小分子化合物-蛋白质靶点相互作用的结构生物学平台，解析了一系列靶点蛋白质-小分子化合物的晶体结构，在PDB数据库中已提交超过12个结构，并有多个新结构正在解析过程中。.本项目实施过程中，申请人已发表通讯作者（含并列）SCI论文7篇，其中中科院二区4篇，另有3篇论文正在投稿中，本项目实施过程中有6名硕士研究生和2名博士研究生获得学位。