LncRNA-MEG3对肝纤维化的调控作用及和血柔肝法干预的分子机制研究

Hepatic fibrosis is the inevitable stage in the process of CLD to liver cirrhosis; it is also the major reason leading to death caused by CVH and FLD. Activated HSC and EMC sedimentation are believed to be the key link of the genesis and development of liver cirrhosis. The previous experiments indicated that long non-coding RNA –MEG3 had a down-regulated expression in the liver fibrosis tissue of mice and been related to the level of HBV Cirrhosis. However, the involved signaling transduction mechanism is still unclear. Our previous research has proved that the method of nourishing blood and soothing the liver has a definite effect on anti-hepatic fibrosis and are superior to the control group in the index of FIB-4 and the improvement of the four indicators of hepatic fibrosis. With the point-cut of MEG3, by applying the tissue specimen of mice with liver fibrosis and hepatic stellate cells(HSCs)in vitro, this study will focus on the following three aspects:(1) to determine the biological function of MEG3 in HSCs through the experiment of function acquirement and deficiency. (2) to screen out the key regulatory molecules related with the biological function of MEG3, by combining the expression profile chip with informatics and biological function analysis; (3)under intervention of the nourishing blood and soothing the liver method, to probe into the mechanism of action of nourishing blood and soothing the liver method and its expression regulation on MEG3 and interacting protein.

肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段，是慢性病毒性肝炎及肥胖相关的脂肪性肝病导致死亡的主要原因。目前多认为HSC激活和ECM沉积是肝纤维化发生发展的中心环节。既往实验表明Long noncoding RNA（LncRNA）-MEG3在小鼠肝纤维化组织中低表达，并与肝纤维程度相关，但其所涉及的靶基因及调控通路尚不清楚。我们的前期研究证实和血柔肝方具有明确的抗肝纤维化作用，在FIB-4指数及肝纤四项的改善方面，优于对照组。本研究拟利用肝纤维化小鼠组织标本和体外培养的肝星状细胞，以MEG3为切入点，开展三方面的研究：（1）利用功能获得与缺失实验，确定MEG3在肝星状细胞中的生物学功能；（2）利用表达谱芯片并结合信息学和生物功能分析，筛选出与MEG3生物学功能相关的关键性调控分子；（3）以和血柔肝方作为干预措施，探讨和血柔肝法对MEG3及相关蛋白的表达调控，阐释其作用机制。

肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段，目前多认为HSC激活和ECM沉积是肝纤维化发生发展的关键环节。如能直接抑制ECM的合成和促进其降解，则已经形成的肝纤维化可逆转。lncRNA作为一种具有重要功能的RNA分子，通过影响下游基因的功能和表达等方式参与肝纤维化的发生发展过程，项目组前期通过查阅文献，发现lncRNA-MEG3在肝纤维化组织中低表达，并与肝纤维程度相关，但其所涉及的靶基因及调控通路尚不清楚，故原计划拟对lncRNA-MEG3在肝纤维化中的作用进行探讨，并采用和血柔肝法（HXRG）干预肝纤维化大鼠后检测MEG3相关蛋白表达情况。为更深入开展后续研究，项目组将原计划中“检测lncRNA-MEG3”扩大为“转录组测序”，但MEG3并未在肝纤维化组与对照组的差异lncRNA中。为深入探讨lncRNA在肝纤维化中的作用，我们对肝纤维化大鼠的lncRNA转录组测序分析结果，发现了10个在肝纤维化过程中表达下调的新型差异lncRNA。其中下调lncRNA靶基因为Met，另外9个下调lncRNA的靶基因为Nox4，两者共表达调控是肝纤维化过程的核心机制。另外，9个lncRNA共同作用于相同的靶基因，表明不同lncRNA之间可能发生级联反应，调控肝纤维化的信号转导通路。共表达网络构建结果表明，Met和NOX4可能参与氧化还原过程和PI3K/Akt信号通路，是肝纤维化相关上调基因调控的核心。同时，为完善及丰富本项目研究内容以及持续开展后续研究，项目组开展了和血柔肝方的以及临床研究，HXRG与恩替卡韦联用，可明显改善CHB肝纤维化患者肝脏纤维化程度，且安全性良好。另外还进行了药效学研究，结果表明HXRG可显著改善治疗组大鼠肝脏炎症及肝纤维化，干预4周后肝组织Metavir评分，显示HXRG各剂量组对肝纤维化均有不同程度改善，改善程度具有时间和剂量依赖效应。我们进一步对5组大鼠肝组织进行了MMP-2/13及其抑制物TIMP-1/2的mRNA和蛋白表达分析。结果表明，HXRG可通过促进ECM降解，最终使肝纤维化程度减轻，发生逆转。我们仍在继续围绕lncRNA靶基因，开展HXRG干预实验，并检测其干预前后的差异，本课题为HXRG抗纤维化机制作了深入的分析探讨，该方具有巨大潜在的转化优势。