基于中度嗜盐菌的好氧颗粒污泥结构稳定化机理及抗逆分子机制

Aim for the key problem of the aerobic granular sludge structure stabilization and salt-tolerant mechanism, this study construct the aerobic granular sludge mainly including the moderate halophilics. To research the moderate halophilic bacterial community structure and function in the dominated granular sludge, clarify the distribution and interaction of filamentous bacteria and moderate halophilics, reveal the interaction of functional bacteria to improve the salt resistance and structure stabilization of granule sludge. To research expression distribution of the compatible solute in the aerobic granular sludge, clarify the corresponding relation of the mass transfer process for the compatible solute with the salt resistance. To research the mechanism of salt-tolerance gene horizontal transfer to strengthen the microbial salt-resistance in the granules, clarify the mechanism of coevolution of moderate halophilic with other bacteria under the high salt conditions. From the reaction kinetics, proteomics and microbial molecular ecology point of view, to reveal the molecular mechanism for moderate halophilic bacteria strengthen the salt-tolerance of the aerobic granular sludge, to construct the control mode of the functional bacterial community. The results not only has important academic value, but also provide the innovative integration technology principle for the biological treatment of high salt and toxic wastewater.

针对好氧颗粒污泥结构稳定化和耐盐抗逆机理的关键问题，构建中度嗜盐菌为主的耐盐好氧颗粒污泥，研究中度嗜盐菌占主导的颗粒污泥群落结构与功能的关系，阐明丝状菌骨架与中度嗜盐菌的空间分布和相互作用，揭示颗粒内部功能菌群相互作用提高耐盐性能和结构稳定化的机理；研究耐盐好氧颗粒污泥内部相容性溶质的分泌和径向分布规律，阐明颗粒内相容性溶质的传质过程和强化耐盐性能的对应关系；研究耐盐基因水平转移机制强化颗粒内微生物耐盐抗逆性能的作用，阐明中度嗜盐菌在高盐胁迫条件下与颗粒内其他菌群的协同进化机制，从反应动力学、微生物分子生态学和蛋白组学等角度，探明中度嗜盐菌强化好氧颗粒污泥耐盐稳定性能的分子机制，建立耐盐功能菌群的调控模式。研究结果不仅具有重要的学术理论价值，也为高盐分、有毒难降解废水的生物处理提供创新的集成技术原理。

本项目针对耐盐好氧颗粒污泥工艺存在颗粒化耗时长、颗粒结构不稳定、耐盐抗逆分子机制不明晰等问题，开发并优化了以中度嗜盐菌为主的好氧颗粒污泥培育策略，探究了耐盐好氧颗粒污泥微观结构稳定化机理与调控机制，揭示了耐盐好氧颗粒污泥盐胁迫条件下降解机理，构建了高效耐盐基因工程菌株，并进行了耐盐降解功能验证。研究结果可为耐盐好氧颗粒污泥技术处理高盐废水提供理论依据和技术参考。. 本研究建立了三种耐盐颗粒污泥培育策略，梯度提升盐度可以培养出好氧颗粒污泥，但存在高盐度（7%）易失稳、培养时间长（58天）等问题；以厌氧颗粒污泥作为晶核可培育出在9%盐度下保持稳定的耐盐颗粒污泥；运用3%盐度直接驯化法可在11 d内实现颗粒化。好氧颗粒污泥菌群结构随着盐度的增加演替明显，耐盐菌属丰度增加，逐渐成为优势菌属。阐明了微生物细胞完整性与胞外多聚物（EPS）的桥连作用是颗粒污泥结构稳定化重要微观机理，细胞结构保持完整及细胞超量分泌EPS（增加量达35.9%）利于维系颗粒微观结构的稳定。揭示了群体感应信号分子与胞内第二信使对耐盐颗粒污泥微观结构稳定的调控机制，N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）有利于疏水性胞外多聚物（EPS）分泌，环二鸟苷酸（c-di-GMP）有利于EPS中胞外多糖（PS）分泌，二者均可通过EPS含量与组成的调控维持颗粒结构的稳定性。探究了高盐胁迫下耐盐颗粒污泥降解活性调控机制，耐盐好氧颗粒污泥中的微生物通过对氨基酸代谢通路、膜转运通路的调控，以产生更多的胞外EPS、胞内相容性溶质等策略来抵抗高盐胁迫压力。向典型中度嗜盐菌V. halodenitrificans PDB-F2体系中投加相容性溶质，表明外源甘氨酸甜菜碱能使PDB-F2尽快适应盐胁迫环境，并且增强其耐盐性；PDB-F2转运基因（betL，opuD1，opuD2和opuD3）的转录水平取决于外部施加渗透压的程度。利用基因工程手段，将合成的耐盐基因元器件导入底盘微生物假单胞菌KT2440中，成功构建了一株具有显著耐盐降解功能的基因工程菌。