C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱的生物合成与结构多样化研究

C3-aromatic pyrroloindolines are a large family of structurally diverse natural alkaloids possessing various important pharmacological bioactivities. However, the synthetic accessibility of their scaffolds, in the attempt to study their pharmacological and biological performance, is made difficult due to their complex structures. In the previous biosynthetic study of a representative pyrroloindoline molecule, we confirmed that its scaffold is synthesized from two molecules of tryptophan-containing cyclodipeptides via a single p450-mediated intramolecular and intermolecular cascade radical reaction. This enzymatic route shows great advantage over the chemical approach, laying out a highly promising blueprint for efficient achieving these unusual scaffold. In this project, we will continue to characterize the biosynthesis of other three widely occurring pyrroloindolines scaffolds. With these basis, we will further develop biocatalytic approaches to harness these efficient p450 reactions to synthesize pyrroloindolines from unnatural cyclodipeptide. Finally, we will evaluate the bioactivities of these unnatural pyrroloindolines to obtain better candidate molecules. The performance of this study can not only provide a systematic understanding of the biosynthesis of C3-aromatic pyrroloindolines, but also make a breakthrough towards accessing such important molecular scaffolds, which will set a solid stage for further pharmacological and biological study of this important natural product family.

C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱是一大类重要的天然产物，普遍具有优异的生物学和药学活性；但由于结构的特殊性，该家族化合物的合成极具难度，很大的限制了其药学和生物学相关的研究。在前期对该家族一类代表性的分子骨架的研究中，我们发现其复杂的分子骨架，是由单个p450蛋白通过分子内和分子间串联的自由基加成反应一步将两分子的色氨酸环二肽转化而成的，展现出了极高的合成效率。本项目中我们将进一步研究另外的三种已知的吡咯并吲哚分子骨架的形成机制；在此基础上，开发生物催化的方法，利用这些特殊的p450反应将诸多化学合成的非天然色氨酸环二肽转化成吡咯并吲哚生物碱，并考察他们的生物学活性，获得有价值的先导化合物。本项目的顺利实施不仅可以系统的形成C3-芳香型吡咯并吲哚生物碱家族的生物合成理论，还能建立起构建和拓展此类重要分子骨架的高效方法，为该家族生物碱的药学和生物学研究奠定坚实的基础。

本项目中，我们从研究NAS-C的生物合成途径出发，对C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱的生物合成机制以及新结构创制进行了研究。我们首先阐明了NAS-C的生物合成途径，发现了参与其生物合成关键步骤的P450酶NascB，并系统揭示了一种基于自由基引发的分子内环化及分子间偶联的高效反应机制，并通过构建大肠杆菌全细胞催化体系以及测试化学合成的35个含色氨酸的环二肽底物，成功获得了30个结构新颖的NAS-C类似物。其次，我们综合利用基因组挖掘、氨基酸序列比对以及解析另一个同源蛋白NASF5053及其突变体的晶体结构等手段，发现四个对反应的区域/立体选择性具有重要调控作用的氨基酸位点，通过分子动力学模拟等方法对四个位点的分子层面的调控机制进行了细致分析，阐明了其对立体和区域选择性的控制机制。再次，针对在大肠杆菌中不可溶、不表达的链霉菌来源的P450,我们发展了一套基于分枝杆菌的高效简洁的全细胞催化体系，证实无需加入外源的电子传递系统即可使P450发挥催化功能，将NascB的同源蛋白NasbB以及NASS1868转化到该全细胞催化体系中，成功创造出12个吡咯并吲哚类生物碱。最后，我们对C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱的集约式生物合成进行了研究，解析了NASF5053中与底物选择性相关的3个关键位点，通过酶工程改造该位点并利用突变体进行催化反应，成功得到12个环二肽自身二聚化产物以及>81个不同底物之间的交叉二聚化产物，极大的增加了该类生物碱的结构多样性，并为后续的酶工程改造提供了非常好的借鉴。通过本项目的实施，我们较好的完成了绝大部分的既定目标以及超额完成了拓展任务，项目实施过程中已发表包括Nature Comm, Angew Chem Int Ed在内的SCI学术论文6篇，专利1项，另有多篇论文正在投稿和整理过程中。本研究成果为C3-芳香型吡咯并吲哚类生物碱的高效生物合成奠定了较坚实的基础。