基于磷酸化蛋白质组学方法分析香大蕉磷酸化信号通路与其抗寒性的关系

Bananas (Musa acuminata AAA Group) are tropical crops and are vulnerable to chilling injuries which are common in late winter and earlier spring in northern banana growing regions in china. In contrast, their close relatives, plantains (Musa paradisiaca L.; ABB Group), are obviously more tolerant to cold. Our previous results from analyzing the transcriptomic and proteomic differences between banana and plantain, following exposure to cold, indicated that ICE1 and the like transcription factors played a key role in orchestrating the transcription of cold responsive genes. But ICE1 and the likes are known to be activated by post-translational modifications like phosphorylation, and the questions such as who are responsible for the phosphorylation processes remain to be answered. In this study, we will analyze changes in phosphoproteomes following treatment of banana and plantain with low temperatures using iTRAQ,TiO2 and nanoLC-MS/MS, aiming at constructing the phosphorylation signal networks involved in responses of banana and plantain to cold and elucidating the importance of protein phosphorylation in cold acclimation. The results should help us to understand better the mechanisms resulting the differences in cold tolerance between bananas and plantains and will probably help us to identify key genes which may be targeted in molecular breeding for cold tolerant bananas.

香蕉属热带作物，在我国北缘产区常受冬春寒潮的侵袭而遭受寒害，主栽品种香牙蕉受害尤甚。但近缘种大蕉却具有明显的抗寒性。课题组前期就香蕉和大蕉的抗寒性差异开展了冷胁迫后香蕉和大蕉的转录组学和定量蛋白质组学研究，结果暗示冷响应转录因子ICE1等起关键作用，但ICE1需磷酸化激酶激活。本研究将应用iTRAQ标记技术、TiO2进行磷酸化多肽富集、nanoLC-MS/MS来分析香蕉和大蕉冷胁迫后的磷酸化蛋白质组变化，构建香蕉和大蕉的冷响应磷酸化信号通路，并探寻其与抗寒性的关系。研究结果可望有助于我们更加深入地了解香大蕉抗寒性的差异，为分子抗寒育种提供靶标基因。

香蕉和大蕉（下文统称：香大蕉）不仅是重要的水果同时也是许多非洲国家不可或缺的食物来源。低温是影响全球香蕉产业最为严重的非生物胁迫之一。为了理解冷抗性的大蕉和冷敏感的香牙蕉抗寒差异的分子机理，本研究：1、比较分析冷胁迫下转录组的差异表明大蕉在受到冷胁迫后，ICE1以及MYBS3基因的表达具有选择性激活的现象，因此我们认为大蕉中ICE1以及MYBS3基因快速的激活以及选择性的诱导配合其他冷响应基因的表达可能是转录水平上大蕉抗寒性优于香蕉的主要原因之一。2、对干涉MpMAPK3基因表达的转基因大蕉进行分子检测和耐寒性测试，结果发现，冷胁迫下转基因植株叶片逐步出现脱水萎蔫的表型，而野生型大蕉仍能保持正常的状态。通过磷酸化蛋白质组学的测定后发现相较于野生型大蕉，转基因植株中与氧化还原酶活性相关的31条差异表达的磷酸化多肽的磷酸化程度受到了严重的抑制，这说明MpMAPK3激酶活性的抑制可能导致转基因植株体内氧化还原代谢途径的紊乱。对丙二醛含量、POD活性的测定发现转基因植株的丙二醛含量显著高于野生对照，POD的活性在冷胁迫下响应程度也低于野生型。综上所述，MpMAPK3可能通过影响大蕉体内的氧化还原代谢通路进而对大蕉的抗寒性起着正调控的作用。3、对香牙蕉和大蕉冷胁迫下磷酸化蛋白质组学数据分析发现以MKK2为中心的互作网络差异显著。对香牙蕉和大蕉悬浮细胞中MKK2蛋白以及包含其磷酸化位点T31的磷酸化多肽进行Western blotting实验发现随着冷胁迫时间的增加大蕉悬浮细胞中MKK2蛋白的丰度呈现下降的趋势，而T31磷酸化位点所在的多肽却表现出显著性的上调；但在香牙蕉悬浮细胞中，MKK2蛋白的丰度保持稳定，而T31的磷酸化没有被检测到。以上这些结果表明大蕉中的MKK2互作网络结合其他特异性响应冷胁迫的磷酸化蛋白的功能可能是大蕉在磷酸化水平上抗寒性优于香牙蕉的重要原因。综上所述，本研究基于转录组、磷酸化蛋白质组学以及基因功能鉴定的方法对香牙蕉和大蕉抗寒差异的分子机制进行了解析，结果将为香蕉抗寒分子育种提供理论依据和改良目标。