miRNAs在断奶仔猪抗F18大肠杆菌感染中的作用机制分析

本研究在前期运用高通量测序筛选F18大肠杆菌抗性型和敏感型断奶仔猪小肠上皮细胞差异miRNAs的基础上，采用poly(A)-tailed PCR和RT-PCR 对筛选的6个目标miRNAs进行验证，结合课题组前期表达谱芯片和蛋白质组学分析结果，分析起核心调控作用的miRNAs及其靶基因，继而利用荧光素酶报告基因系统对靶基因进一步进行验证，得到与断奶仔猪F18大肠杆菌抗性调控最相关的关键靶基因。建立稳定转染的关键靶基因过表达和RNAi阳性的IPEC-J2小肠上皮细胞系，通过小肠上皮细胞黏附和黏附抑制实验，研究关键靶基因对断奶仔猪小肠上皮细胞F18大肠杆菌黏附状态的影响，精确分析关键靶基因的功能。本研究从miRNAs 层面上，与前期mRNA和蛋白质水平的研究结果有机结合，可进一步加深对断奶仔猪F18大肠杆菌抗性调控机制的认识，为中国地方猪品种大肠杆菌病抗性研究和育种实践奠定坚实基础。

本研究运用Illumina Solexa高通量测序技术，对E. coli F18敏感型和抵抗型断奶仔猪全同胞配对组中每个个体十二指肠小RNA文库进行测序，筛选差异miRNA，以期为增加猪miRNA数据库信息、了解中国地方猪种与外来猪种抗E. coli F18的遗传基础差异以及寻找抗E. coli F18感染的新标志物提供一定的依据。测序结果显示，所有个体十二指肠中均含有90%以上的已知猪源miRNA。对比组之间共筛选到58个差异miRNA，其中上调46个，下调12个，表达量最高的为ssc-mir-143，其次为 ssc-let-7f，ssc-mir-192和ssc-mir-21等。将差异miRNA序列比对到人的数据库后预测得到的靶基因与前期表达谱结果相综合，共得到2036个交集基因。对交集基因进行GO和Pathway分析发现，差异miRNA主要参与了机体的免疫应答和转录调控功能。结合差异miRNA表达量及其与转录因子间的调控关系等信息，本文共确定12个候选差异miRNA，其中11个上调miRNA：ssc-mir-143，ssc-let-7f，ssc-mir-30e，ssc-mir-148a，ssc-mir-148b，ssc-mir-181a，ssc-mir-192，ssc-mir-27b，ssc-mir-15b，ssc-mir-21，ssc-mir-215；1个下调miRNA：ssc-mir-152。荧光定量结果显示目标miRNA在扩大样本量的E coli F18敏感组和抗性组间表达变化与高通量测序结果一致。通过表达谱芯片与小RNA芯片数据联配获得显著差异表达（p<0.05）的miRNA和mRNA，筛选的 mir-215对应的靶基因ALCAM、DLG5、FRMD4B、MIPOL1、ZFHX3以及mir-15b、let-7f对应的共同靶基因EGLN2、CDC14B、MAP4K3、ABL2、PRKAB2，通过种子序列验证miRNA和mRNA 的对应关系，GO和KEGG通路分析得知，这些基因共同参与细胞周期、细胞骨架作用、胰岛素信号转导和MAPK信号通路过程中。