FUT1基因启动子区对断奶仔猪大肠杆菌抗性的调控机制分析

A large number of studies have shown that α(1, 2)-fucosyltransferase gene (FUT1) plays an important role in regulating the process of the resistance to Escherichia coli infection in weaning piglets, but the coding region of FUT1 gene shows highly conservative in Chinese native pig breeds. Therefore this study focuses on the analysis of FUT1 promoter region and confirms the key promoter sequence by bioinformatics prediction and experimental verification. Additionally, the SNPs (single nucleotide polymorphisms) and methylation sites of FUT1 key promoter region were detection in the selected individuals of E.coli F18-resistant and -sensitive Meishan weaning piglets. The important variation sites were screened out combining the predictive analysis of transcription factor binding sites and systematically analyzed whether the variation sites were related to the resistance to E.coli of weaning piglets. Meanwhile the key transcription factors and cis-acting elements were identified with the methods of bioinformatics, literature mining, point mutation analysis, EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) and CHIP (Chromatin Immunoprecipitation). Using the overexpression and interference experiment of key transcription factors in pig small intestine epithelium, and then analyzed and validated whether key transcription factors or cis-acting elements affected the expression level of FUT1 gene and the resistance to E.coli of weaning piglets. Through the systematic analysis and continuous verification of the function of key transcription factors and cis-acting elements, which aimed to illuminate the regulation mechanism of resistance to E.coli by FUT1 promoter region in weaning piglets, and lay a solid foundation for the breeding of disease resistance to E.coli in Chinese native pig breeds.

大量研究表明，FUT1基因在断奶仔猪抗大肠杆菌感染过程中发挥了重要的调控作用，但是中国地方猪种FUT1基因编码区高度保守，因此本研究锁定其启动子区，通过生物信息学预测和实验验证确定核心启动子序列，在确证的梅山猪抗性和敏感型断奶仔猪中，检测核心启动子区域SNPs及甲基化位点，结合转录因子结合位点的预测分析，筛选顺式作用元件中重要的变异位点，系统分析其与断奶仔猪大肠杆菌抗性的关系；同时，利用生物信息学、文献挖掘、点突变分析、EMSA和CHIP等手段鉴定关键的转录因子及顺式作用元件，在猪小肠上皮细胞系中过表达和干扰（基因敲入）关键的转录因子，分析验证关键的转录因子及顺式作用元件对基因表达及断奶仔猪大肠杆菌抗性的影响；通过对重要变异位点、关键转录因子及顺式作用元件功能的系统分析和层层验证，以期阐明FUT1基因启动子区对断奶仔猪大肠杆菌抗性的作用及其机制，为地方猪种抗大肠杆菌病育种提供依据和指导。

F18大肠杆菌是断奶仔猪腹泻最常见和重要的病原菌之一，地方猪品种对其抗性的调控机制有待深入阐明。课题前期筛选并确定球系列鞘糖脂生物合成通路及其关键基因FUT1、FUT2对F18大肠杆菌抗性具有重要调控作用。在此基础上，本研究在细胞、蛋白质、DNA、mRNA和个体水平上，系统分析与验证基因表达水平与大肠杆菌抗性的关系，同时分析重要的甲基化位点、转录因子及顺式作用元件对FUT1和FUT2基因表达的影响。此外，利用PCR-SSCP检测FUT1与FUT2启动子区遗传变异位点在不同猪品种群体的遗传分布，并结合重要细胞因子检测、生长与繁殖性能指标测定，进一步评估其作为有效遗传标记的可行性。结果显示，FUT1在抗性与敏感型个体肠道组织中表达水平差异不显著，LPS诱导和菌体刺激小肠上皮细胞后FUT1表达均无显著变化，FUT1沉默表达后细胞与大肠杆菌黏附能力无显著变化（P>0.05），表明FUT1对大肠杆菌抗性调控与表达水平无关，可能与其酶催化活性有关；FUT2在敏感型肠道组织中表达水平极显著高于抗性型，并且LPS诱导和菌体刺激小肠上皮细胞后FUT2表达均出现极显著升高（P<0.01），FUT2沉默后细胞与大肠杆菌黏附能力出现显著的降低（P<0.05），FUT2过表达后细胞与大肠杆菌黏附能力出现极显著的升高（P<0.01），由此表明FUT2下调表达有利于提高仔猪对大肠杆菌的抗性。抗性与敏感型肠道组织甲基化测序显示，FUT1基因扩增片段有18个CpG位点；35日龄仔猪的FUT1 mRNA表达显著高于8日龄和18日龄仔猪（P<0.05），并且FUT1 CpG岛甲基化与mRNA表达显著负相关（P<0.05）。FUT2基因扩增片段有21个CpG位点，mC-6和mC-22位点的甲基化程度与mRNA表达存在显著的负相关（P<0.05），其中mC-22位点位于Sp1转录因子结合位点上，EMSA试验分析与验证甲基化修饰抑制了Sp1转录因子与FUT2启动子DNA的结合，进而降低其表达水平。此外，在不同猪品种群体中检测到FUT1基因T(-726)C和FUT2基因rs345476947功能突变位点。本研究阐明了FUT1和FUT2基因启动子区对断奶仔猪大肠杆菌抗性的作用及分子机制，为地方猪种抗大肠杆菌病育种提供了依据和指导。