Math5调控视网膜Müller细胞定向分化为神经节细胞的研究

本研究拟将pGC-FU-Math5-GFP慢病毒载体转染体外培养的鼠视网膜Müller细胞去分化而来的视网膜干细胞，免疫荧光染色法检测此类视网膜干细胞定向分化为视网膜神经节细胞的形态和数量，Western-blot、RT-PCR法检测干细胞和分化细胞中Math5、Brn-3b、Isl1、Notch的表达差异。然后将pGC-FU-Math5-GFP慢病毒载体注射入高压眼模型鼠的玻璃体腔内，免疫荧光染色、荧光金逆行标记、Western-blot、RT-PCR法观察视网膜Müller细胞的增殖和分化情况以及神经节细胞的形态、数量，并检测视网膜中Math5、Brn-3b、Isl1、Notch表达差异。最后采用TUNEL技术分析视网膜细胞凋亡情况。从而揭示Math5对视网膜Müller细胞定向分化为视网膜神经节细胞的调控作用、作用机制及副作用，为进一步推动青光眼视神经再生治疗奠定坚实的理论基础。

青光眼是一种慢性、进行性视神经损伤病变，以视野缺损和视神经损害为共同特征的疾病。其有关具体发病机制不明，存在着多种学说，但是无论哪种类型的青光眼，视网膜神经节细胞的进行性、选择性死亡均是青光眼视神经损伤的最终共同结局。目前虽有大量保护视网膜神经节细胞的治疗方法，仍无法有效阻止其进行性损害。视网膜Müller细胞是一种潜在的视网膜干细胞，又来源于自身，且含量丰富，有可能成为替代受损的视网膜神经元的重要来源。Atoh7是温血类脊椎动物神经节细胞形成所必需的关键调控基因，并且Atoh7基因的下游基因Brn-3b 和LIM-HD转录调控因子家族中的Isl1均参与了鼠胚胎期视网膜神经节细胞的发育和分化，并且这两种转录因子具有协同作用，同时与Notch/Delta信号通路的下调也密切相关。因此我们课题组在视网膜Müller源性干细胞向神经节细胞分化过程中对上述调控通路进行了细致深入的研究。. 我们课题组通过对胰酶消化传代方法的改良，形成了新的视网膜Müller细胞提纯方法。提纯后的视网膜Müller细胞在促有丝分裂因子以及神经生长因子的刺激下成功去分化为视网膜干细胞，表现出活跃的增殖能力和良好的干细胞特性。Atoh7基因对视网膜Müller细胞来源的干细胞向神经节细胞定向分化有显著的正调控作用，同时上调其下游基因Brn-3b和Isl-1，且Atoh7、Brn-3b和Isl-1三种基因对干细胞向神经节细胞的分化具有协同作用。Atoh7基因即可上调其下游基因Brn-3b和Isl-1，又可移植负调控通路Notch基因；Brn-3b和Isl-1基因敲除以及GSI均可显著抑制视网膜干细胞向神经节细胞定向分化，而Atoh7、Brn-3b和Isl-1三种基因的上调和Notch基因的下调共同参与了视网膜干细胞向神经节细胞定向分化的调控。采用激光光凝的方法成功建立了SD大鼠青光眼模型，玻璃体腔注射Atoh7基因慢病毒载体感染的干细胞，干细胞能突破视网膜内界膜逐渐向视网膜深层间迁移，并最终聚集于视网膜内核层和外核层，同时定向分化为视网膜神经节细胞，证实Atoh7基因在青光眼模型鼠视网膜内对视网膜Müller来源的干细胞向神经节细胞的定向分化具有显著调控作用。