系统性硬皮病中CD40配体基因逃避X染色体失活的机制及作用研究

系统性硬皮病(SSc)是一种以女性为主的（80％以上）、多器官纤维硬化为特征的疾病，主要病理特点为成纤维细胞（FB）异常活跃，合成大量胶原纤维沉积在组织中。为何常累及女性？其机制尚不完全清楚。正常状态下，女性2条X染色体中的1条处于失活状态。表观遗传学机制在X染色体失活中起重要作用。我们最近的研究显示，DNA甲基化抑制剂可激活正常女性T细胞原已失活的X染色体，导致某些基因过度表达，CD40 配体就是其中之一。T细胞通过CD40/CD40配体在激活B细胞功能、诱导FB活化中起关键作用。本课题研究SSc患者T细胞CD40配体表达水平与其调控序列甲基化状态及染色质结构松散程度的关系；DNA甲基化抑制剂对CD40配体基因调控序列甲基化水平及染色质结构的影响。探讨DNA甲基化对T细胞X染色体编码基因CD40配体表达的调控及其在SSc发病中的作用，试图揭示女性易患的根源，为该病的治疗提供崭新的途径。

背景：系统性硬皮病（systemic sclerosis，SSc）是一种自身免疫性结缔组织疾病，以自身抗体产生、皮肤及多系统器官进行性纤维化、微血管病变为主要特征，发病率具有明显性别差异，80%以上患者为女性，其发病机制目前尚未完全清楚。有研究发现CD40配体（CD40L）在SSc病人和硬皮病模型小鼠中过度表达，但CD40L在SSc中表达增高的机制尚不清楚。我课题组之前研究发现DNA甲基化抑制剂可激活正常女性原失活的X染色体，导致CD40L过度表达。因此，本课题通过比较男女SSc患者CD40L表达水平和其调控序列DNA甲基化状态，试图探讨SSc患者CD40L增高的原因，为该病发病机制的研究提供新的思路。.研究内容：密度梯度离心法分离26例SSc患者(女16例，男10例)和25例健康对照者（女15例，男10例）的外周血单个核细胞，流式细胞术检测CD4+T细胞中CD40L的表达水平；磁珠分选CD4+T细胞，实时定量聚合酶链反应（real-time RT-PCR）检测CD40L的mRNA表达水平；亚硫酸氢钠测序检测CD4+T细胞中CD40L基因调节序列的甲基化状态。与女性正常对照组相比，女性SSc患者CD4+T细胞中CD40L mRNA的表达水平显著升高（P<0.05）,CD40L的蛋白表达水平亦显著升高（P<0.05）；亚硫酸氢钠测序结果显示正常女性CD40L基因调控序列一半呈甲基化，一半呈去甲基化，而正常男性CD40L相同序列大部分呈去甲基化，女性SSc患者CD40L基因启动子和增强子区域平均甲基化水平均显著低于女性正常对照（P<0.001；P<0.001）,并且女性SSc患者CD40L启动子和增强子区域平均甲基化水平与其CD40LmRNA表达水平呈显著负相关（r = -0.629, P < 0.01；r = -0.727, p < 0.01）；男性SSc患者组与男性正常对照组CD40L mRNA和蛋白表达水平均无显著差异（P>0.05； P>0.05），并且两组CD40L基因启动子和增强子区域甲基化程度均较低，其平均甲基化水平无显著性差异（p>0.05；p>0.05）。.结果：女性SSc患者CD4+T细胞中CD40L表达显著增高，而男性患者无明显改变；女性SSc患者CD40L基因调控序列低甲基化使原失活的X染色体活化，其上的CD40L基因功能活化，从而导致CD4