帕金森病发病机制中自身抗体靶蛋白的筛选和鉴定

帕金森病（PD）是中枢神经系统常见的变性性疾病，多巴胺神经元的特异性损害，是PD发病的重要特点。近年来的研究提示，帕金森病患者血清和脑脊液中存在自身抗体，可能参与对多巴胺神经元的特异性损害。然而，自身抗体攻击的靶目标尚不清楚。本课题组研究发现，脑黑质组织中的35kDa蛋白可能是体液免疫中自身抗体攻击的靶蛋白。本项目拟在已有的研究基础上，首先，利用Western-blot结合二维电泳技术进一步分离和筛选自身抗体针对的靶蛋白；继而，利用质谱检测和Denoval技术对筛选出的靶蛋白进行鉴定；然后，利用靶蛋白特异性抗体和RNAi技术，对该靶蛋白在PD发病中的作用进行鉴定；最后，利用免疫组化和激光共聚焦技术对该靶蛋白在黑质内进行细胞定位。本研究将有利于进一步阐明体液免疫在PD发病中的作用，并初步确定黑质区神经细胞上与发病相关的靶蛋白，为帕金森病的免疫治疗和免疫诊断提供新思路和新策略。

背景 帕金森病（PD）A9与A10区多巴胺神经元的损害差异是PD的重要病理特点。本研究拟寻找PD血清中自身抗体的靶抗原，并探讨其在PD发病中的作用。方法（1）使用IHC方法分别使用PD动物血清和PD患者血清，从细胞学水平研究血清和脑内蛋白的相互作用。（2）使用Western-blot、免疫共沉淀（IP）、质谱检测和ELISA的方法, 从分子水平上探讨自身抗体的作用。（3）使用功能核磁共振通过对血脑屏障的研究，初步探讨自身抗体参与PD发病的机制。结果（1）免疫组化提示正常和PD小鼠血清均可与小鼠黑质切片有弥漫性结合（中脑、皮层及海马等）；使用PD与对照组血清，结果和动物模型一致，但未见PD组血清与黑质有突出结合。（2）Western-blot、免疫共沉淀（IP）、质谱检测和ELISA的方法提示PD与对照组血清及提纯的血清IgG均与黑质蛋白有较多结合，提示存在抗原抗体反应；采用IP技术，结果提示血清IgG仅与黑质膜蛋白结合，而与胞浆蛋白无结合，且与膜蛋白在不同分子量均有结合条带，PD与对照组间偶尔有差异条带，但差异条带少、变异大、重复性欠佳。（3）质谱检测IP产物，提示和自身抗体结合的蛋白在PD和对照组均有多种，包括α微管蛋白、细胞角蛋白、Omi/HtrA2、突触泡蛋白、UQCRC1及多种与ATP合酶形成有关的膜蛋白等。（4）α微管蛋白、突触泡蛋白、UQCRC1作为靶蛋白在PD组检出频率较高。使用ELISA实验提示PD和对照组均存在上述三种抗体，两组间抗体水平和高抗体水平发生率两组间无差异。（5）实验中找到的靶蛋白均为已知的广泛存在于亚细胞结构的蛋白，不属于A9与A10区多巴胺神经元的差异蛋白，考虑参与PD发病是中脑局部血脑屏障（BBB）损害的结果，但是普通功能磁共振不能观察到PD患者中脑BBB损害表现。结论：本研究证实，PD和对照组血清的IgG可与脑组织中的多种靶蛋白结合，还需要利用细胞培养等技术改进靶蛋白的筛查方法才可能找到更特异的自身抗体；目前我们发现的多种自身抗体，在中脑血脑屏障损害的前提下，可能造成PD发病及进展，因此基于特定区域的血脑屏障损害是今后PD与体液免疫的研究方向之一。