家蚕杆状病毒蛋白Bm65的核酸内切酶活性分析及在病毒与宿主抗紫外线辐射中的作用

Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) orf65 (Bm65) is an essential gene for viral propagation, and predicted to be an endonuclease involved with the repair of DNA damage by UV light. Our recent evidences indicate that Bm65 is important for BmNPV and BmNPV-infected cells to resist UV irradiation. To test whether Bm65 is able to repair this damage and what other components are implicated in this repair pathway, we will perform the following experiments in the project: (1) Determination of the endonuclease activity of Bm65 in vitro; (2) Analysis of the roles of Bm65 in the UV irradiation; (3) Analysis of Bm65 expression and identification of the interaction proteins with the BmNPV-infected BmN cells under UV-irradiating and normal conditions. This study is helpful for understanding the molecular mechanism of BmNPV to resist UV irradiation and the interactions between virus and host, which is important for controlling the spread of viral infection and application of BmNPV-based anti-pest drug.

申请者前期研究表明BmNPV orf65为病毒增殖的必需基因，预测为与紫外线损伤修复有关的核酸内切酶。过表达Bm65的重组病毒经过相同剂量的紫外线（UV）处理后，较野生型病毒增殖更快。过表达Bm65重组病毒感染的家蚕细胞较未感染及被野生型病毒感染的细胞，表现出对紫外线更强的耐受性。鉴于以上前期基础，本项目拟开展(1) 体外鉴定Bm65的核酸内切酶活性；(2)Bm65的核酸内切酶活性对病毒及宿主细胞抗紫外线辐射的作用研究；(3) 紫外线辐射下，Bm65的表达情况及其互作蛋白的鉴定。该研究有助于了解杆状病毒抗紫外线途径及理解紫外线辐射下病毒与宿主的关系，从而为防控与改造杆状病毒、创建新型杆状病毒生物杀虫剂及优化杆状病毒表达系统提供理论依据。

目前，绝大部分杆状病毒的紫外线（UV）损伤修复机制尚不清楚。BmNPV Bm65属于GIY-YIG核酸内切酶家族，预测与UV诱导DNA损伤的修复有关。在本研究中，主要进行了以下研究：（1）分析了Bm65在UV诱导损伤的修复中的作用并确定起作用的关键结构域。DNA ELISA实验证实了Bm65有助于修复UV引起的DNA损伤。宿主细胞反应实验发现Bm65能增强受UV损伤的报告基因的表达。对Bm65进行了一系列截短突变，发现N-端氨基酸序列中包含了GIY-YIG结构域，对于Bm65的功能非常重要。（2）分析了Bm65的亚细胞定位、表达模式及UV诱导对Bm65表达的影响。UV诱导损伤后，Bm65的亚细胞定位实验显示Bm65可能聚集在UV损伤处。进一步发现Bm65以四聚体形式存在，推测该蛋白在感染的细胞中以四聚体的形式发挥作用。当病毒或宿主细胞受UV辐射后，Bm65的表达都会显著升高。（3）分析了Bm65影响病毒及宿主修复UV诱导的损伤。发现表达Bm65能提高大肠杆菌及重组病毒经UV辐射后的存活率。瞬时表达Bm65蛋白或感染过表达Bm65的病毒后，家蚕细胞都表现出对UV更强的耐受力。（4）分析了Bm65的互作蛋白。免疫共沉淀技术和LC-MS/MS分析发现未用UV处理鉴定到了32个与Bm65相互作用的宿主家蚕蛋白，而用UV处理后只鉴定到了6个与Bm65相互作用的宿主家蚕蛋白。具体的互作关系还在进一步的验证，这些相互作用调控哪些生命过程还有待深入的研究。以上这些前期实验结果提示Bm65与UV引起的DNA损伤修复有关，并在宿主受到UV辐射时有助于宿主修复损伤。这些研究为阐明BmNPV对UV诱导损伤的修复机制打下基础。对于更好地理解杆状病毒与宿主在长期进化中的相互关系及改造新型的杆状病毒生物杀虫剂提供一定的参考。