WNK3激酶调控SCN区昼夜节律的机制研究

哺乳动物昼夜节律中枢(SCN区)的神经元内各"钟控基因"转录变化形成节律震荡，并主要通过GABA进行细胞间信息整合形成同步节律输出。而对参与中枢节律维持或适应性变化调控的分子了解还非常有限。本研究提出WNK3激酶参与了哺乳动物中枢昼夜节律的调控。我们前期结果提示大鼠SCN区WNK3基因的转录存在昼夜节律变化，并完成大鼠WNK3 siRNA有效序列验证及慢病毒颗粒制备。已知WNK3参与海马GABA能神经元的兴奋性调节且在SCN区也高表达，其在植物中的同源蛋白能直接磷酸化钟蛋白参与节律和花期调控。因此我们将在脑片功能和分子水平进一步研究WNK3对哪些钟蛋白有磷酸化调控，和(或)是否影响胞内Cl-浓度从而调节GABA能神经元兴奋性。在体外和在体水平阐明调控方式，位点等机制，并探讨位点干预措施对昼夜节律紊乱模型的作用。从而为拓宽昼夜节律调控理论和指导治疗节律紊乱性睡眠障碍的药物研发提供新的靶点。

现代化的工作、生活方式和压力导致的睡眠障碍的发生率显著上升，睡眠障碍又会进一步引起或加重心血管病、肿瘤、自身免疫性疾病及抑郁症等严重疾病。研究睡眠障碍的产生和作用机制则为特异性干预措施的研制提供理论基础。睡眠障碍发生的根源是生物自身节律和外界节律不匹配。在睡眠节律发生的中枢下丘脑室上核（SCN）区 ，昼夜节律产生的分子机制是一系列钟基因分子的 协调反馈性震荡引发的，而对这些分子的调控机制的了解却几乎空白。本研究拟对WNK3激酶在SCN区参与睡眠中枢节律发生的调节机制进行探讨。目前主要取得了以下重要研究结果：1. 免疫组化研究提示SCN神经元表达WNK3激酶蛋白，且通过多时点取样Western Blot检测半定量表达水平，进一步通过余弦曲线软件拟合观察到WNK3蛋白在24小时内表达水平的波动具有节律曲线的特征。2. 通过立体定位向SCN内注射包装有WNK3基因表达干扰序列的病毒从而在活体动物SCN区特异性敲减WNK3基因的表达， 动态脑电图描记的动物睡眠时间分布曲线提示WNK3基因的敲减会对睡眠在昼夜时间段的分布造成影响，敲减与对照组在睡眠昼夜分布曲线的相位和中值具有显著性差异，而振幅的变化则不明显，提示内源性WNK3蛋白的节律性表达可能参了SCN区的时间调定功能。3.通过免疫共沉淀发现WNK3 与钟蛋白分子PER1在体外存在结合，在体外建立的节律细胞模型中应用WNK3 si、Control si、EYFP及WNK3CD K159M（激酶失活突变体）感染或转染后，应用Western Blot 检测细胞内钟基因Per1的节律性表达，结果提示WNK3si 和WNK3K159M均对Per1表达的节律变 化产生显著影响。进一步通过Per1 promoter 下游的Luciferase 报告基因的检测也得到一致的结果。4. 我们进一步对不同性别节律模型进行比较，发现SCN区WNK3 激酶以及多种钟基因的表达和转录在不同性别节律动物上具有不同的波动规律。综上，目前研究结果提示WNK3激酶可能通过对钟蛋白的磷酸化进行影响从而参与昼夜节律中枢的活动调节，为理解睡眠节律中枢的调节机制以及研究直接针对睡眠中枢的干预措施提供重要依据。目前研究仍在继续，但已经获得关键性的结果，预期在半年内投稿。目前已发表SCI 论文2篇，国内杂志论文十余篇，综述及受邀述评三篇，专利6项，基本完成预期目标。