MicroRNA-21调控卵巢癌相关成纤维细胞转化介导的促肿瘤演进研究

MicroRNAs是最大的一类基因表达调控因子，通过与靶基因3'端未翻译区"种子序列"的结合负性调节基因表达，几乎参与所有生命过程。作为肿瘤细胞高表达的关键"促癌microRNAs"之一-microRNA-21(miR-21)，我们前期研究显示，miR-21参与卵巢癌相关成纤维细胞转化，但尚不清楚这种miR-21"激活的"间质成纤维细胞的旁分泌作用对肿瘤演进的影响。本项目拟应用模拟卵巢癌微环境的二维和三维细胞模型，验证miR-21参与卵巢癌相关成纤维细胞转化；探讨这种"激活的"成纤维细胞通过旁分泌作用对肿瘤增殖、侵袭、转移和血管形成的影响及其机制；进一步应用特异性miR-21抑制剂干预卵巢癌动物模型，通过在体实验研究阻断肿瘤相关成纤维细胞转化的抗肿瘤作用。本研究将丰富miR-21作为"oncomiR"的功能阐释，将为miR-21成为卵巢癌靶向间质的治疗靶点提供实验依据。

目的：肿瘤细胞分泌的TGF-β1诱导肿瘤间质肌纤维母细胞的转化表现为一系列表型和功能基因的表达改变。miRNAs作为重要的基因负性调节因子，本研究探讨参与卵巢癌肿瘤间质肌纤维母细胞转化的miRNAs。方法：1.应用real time RT-PCR方法检测一系列候选参与肿瘤间质肌纤维母细胞转化过程相关的miRNAs的表达水平。2.应用miR-21抑制物和类似物转染人纤维母细胞，探讨miRNA-21在卵巢癌间质肌纤维母细胞的转化过程中的作用，探讨抑制或上调miR-21是否可以抑制或促进肿瘤间质肌纤维母细胞的转化过程中转化标志基因和功能基因的表达。3.应用计算机软件预测肿瘤间质成纤维细胞转化过程中miR-21的靶向调控基因，应用构建包含miR-21靶基因调控程序性细胞死亡4基因 (PDCD4)3’-UTR的荧光素酶报告载体方法和应用转染或敲除miR-21后检测纤维母细胞中PDCD4表达水平的变化，确定PDCD4是否是miR-21在肌纤维母细胞转化过程中的靶向调节基因。结果：1.应用卵巢癌细胞CM或TGF-β1培养人纤维母细胞，细胞内miR-21表达水平上调（P＜0.05）。2.应用miR-21抑制物和类似物转染纤维母细胞，miR-21抑制物可以抑制CM或TGF-β1诱导的肿瘤间质肌纤维母细胞的转化过程中α-SMA等转化标志基因和功能基因的表达（P＜0.05）。3.构建含有miR-21潜在结合位点的PDCD4基因3’UTR荧光素酶报告载体，其与miR-21抑制剂或模仿剂共转染入纤维母细胞，miR-21模仿剂增加miR-21的表达而抑制荧光素酶活性，而miR-21抑制剂显著增加荧光素酶活性（P＜0.05）。提示，在纤维细胞中miR-21能够结合到PDCD4基因的3’UTR。4.应用特异性转染或沉默方法，miR-21模仿剂和miR-21抑制剂分别降低和升高纤维母细胞中PDCD4的蛋白表达，并且转染miR-21抑制剂可以拮抗TGF-β1诱导的miR-21内源性负性调节PDCD4表达的作用。结论：miR-21参与卵巢癌细胞CM或TGF-β1诱导的肿瘤间质肌纤维母细胞转化，抑制或上调miR-21可以抑制或促进肿瘤间质肌纤维母细胞的转化过程中α-SMA、CLIC4等转化标志基因和功能基因的表达。miR-21通过靶向调节PDCD4促进肿瘤间质肌纤维母细胞转化作用。