肾阳虚证免疫基因-蛋白分子网络调控及中药网络修复效应机理研究

前期肾阳虚证-基因组研究发现免疫基因及分子通路集中表达，提示肾阳虚证是以免疫基因为主导的多维分子网络调控失衡。前期研究也积累近20万点的肾阳虚证基因表达谱数据，如此海量数据仍有可深入挖掘的空间。.本计划拟整合前期肾阳虚证基因表达谱数据及本计划将产生的蛋白表达谱数据，以Gene-Rel-Net等网络建模方法，挖掘肾阳虚证免疫基因-蛋白分子网络调控模式并定位其关键调控位点及温补中药的网络修复效应。研究分三个层次：① 81张基因表达谱数据的分子网络建模；②肾阳虚证、健康对照及中药疗效各10例的蛋白表达谱特征；③数据融合，GeneTS R package挖掘肾阳虚证免疫基因-蛋白分子网络调控和中药的网络修复效应。. 本实验整合系统生物学前沿方法，重点定位于toll样受体信号通路和与之相匹配的基因（TRL4,MYD88,IL-1等）及蛋白质，从功能到关系，从关系到网络，深化肾阳虚证科学内涵。

本计划采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)蛋白质组学技术，筛选肾阳虚证差异表达蛋白，并整合前期肾阳虚证基因表达谱数据，以BisoGeneNet等网络建模方法，挖掘肾阳虚证免疫基因和蛋白分子网络调控模式并定位其关键调控位点，分析温补中药网络修复效应分子机制。课题主题进展有三个方面：1.肾阳虚证辨证因子梳理及核心因子筛选：分析4140例被调查者的四诊数据，发现腰痛酸软在老龄人口中出现频率较高（49.2%），而且和肾阳虚证其它主症的出现存在着较高的一致性，奠定了腰痛酸软在肾阳虚证症状群中的突出地位，对肾阳虚证诊断的客观化和标准化有一定的理论指导意义。另外，对职称分别为主任医师、主治医师、医师的3名中医内科医生各自完成的54例有效调查结果作一致性分析，发现职称越高，对肾阳虚证及其各辨证因子判断的一致性越好，说明职称的高低和诊断准确度有相关性，为中医的经验医学性质提供了理论依据；2.肾阳虚证基因表达谱数据的分子网络建模：将81张基因芯片数据分类整理并归一化后，进行多角度的数理分析。通过Significance Analysis of Microarray（SAM）芯片数据分析软件筛选肾阳虚证显著表达基因。筛选到70条显著表达基因，其中与免疫相关的有18条。提示免疫功能基因的异常表达是肾阳虚证发生的分子基础之一。进而筛选右归丸治疗前后患者完成的8张治疗前后的基因芯片数据，筛选到25个显著调节基因。采用BisoGenet工具构建差异调节基因功能网络，并对基因功能网络结构进一步细化，得到一个免疫反应功能相关基因模块，说明肾阳虚证存在免疫分子网络的失衡，而右归丸可以通过调节一系列免疫分子的相互关系来纠正这种网络失衡状态。本研究从基因功能网络角度，为肾阳虚证的病理机制及其分子疗效基础研究开辟了新思路；3.肾阳虚证蛋白表达谱特征及中药网络修复效应研究：采用iTRAQ蛋白质组学技术，筛选并鉴定肾阳虚证患者右归丸治疗前后差异表达蛋白, 并对差异表达蛋白进行生物信息学分析。结果共鉴定血清蛋白236个，有定量信息的171个，其中补体C3、APOC3、Cystatin-C, APOE为右归丸疗效相关的关键蛋白。本研究内容的开展为中医药疗效评价和中医治未病提供了拓展研究的空间。本项目发表核心期刊论文10篇，培养或正在培养硕士研究生2名。