解脂耶氏酵母双极出芽地标蛋白的鉴定和功能研究

During the new bud assembled in Yarrowia lipolytica, the position of a new budding site, which also defines the future cell division plane, is often not randomly chosen, they often choose the distal pole of the last division site as the new budding site, this pattern of bud site selection is called the bipolar pattern. The bipolar budding is controlled by series genes and reflect the spatial regulation during the yeast polarity growth. In this procedure, the landmark proteins can provide the spatial landmark signal to direct the new buds are assembled in the correct position. At present, the research on the bipolar landmark proteins in Y.lipolytica has not been carried out. In order to analysis the function and mechanism of the two potential bipolar landmark proteins YlRax1 and YlRax2, we plan to identify the function and the functional domain of them, detect the relationship between the two proteins and isolate proteins that may have related functions with them. Besides, we will isolate the new potential bipolar landmarks through the bipolar budding defect mutants which are obtained by randomly insert, to further clarify the composition and mechanism of the bipolar spatial landmark proteins in Y. lipolytica, as well as raise the new potential molecular mechanism of bipolar budding, which will be important for the understanding of the regulation mechanism of bud site selection in fungi.

解脂耶氏酵母进行出芽繁殖时，决定未来分裂平面的出芽位置不是随意选取的，而是选择在前一次细胞分裂位置的对侧出芽，即进行双极出芽。双极出芽是由多个基因控制的，反映了酵母在细胞极性化过程中存在着空间调控。在这个过程中，地标蛋白负责提供空间地标信号，指导细胞在正确的位置组装新的芽体。目前对解脂耶氏酵母双极出芽地标蛋白作用机制的研究几乎没有开展。我们计划通过鉴定解脂耶氏酵母中可能的地标蛋白YlRax1和YlRax2的功能、功能结构域，检测这两个蛋白之间的相互作用，筛选与之功能相关的蛋白，来分析这两个蛋白在解脂耶氏酵母双极出芽过程中的功能以及它们的作用方式。同时也将通过插入突变筛选新的可能的双极出芽地标蛋白并对其功能进行研究，以便进一步阐明解脂耶氏酵母中双极出芽空间地标蛋白的组成及作用机制，提出新的可能的双极出芽分子调控机制，对进一步理解真菌的出芽位点选择调控机制有非常重要的科学意义。

解脂耶氏酵母以双极出芽的方式进行出芽位点的选择，在这个过程中，地标蛋白负责提供空间地标信号，指导细胞在正确的位置组装新的芽体。目前对解脂耶氏酵母双极出芽地标蛋白作用机制的研究几乎没有开展。在本项目的资助下，我们对可能的双极出芽地标蛋白YlRax1和YlRax2的功能，相互作用关系以及作用方式进行了鉴定。通过基因敲除以及观察蛋白的定位，我们发现YlRax1和YlRax2是作为双极出芽地标蛋白参与调控解脂耶氏酵母的双极出芽，但该调控是部分的，这两个蛋白缺失后只能使细胞的出芽位点选择方式由双极出芽转变为单极出芽，而不是完全无序的随机出芽。通过双缺失菌株的构建，融合蛋白定位的观察以及双分子荧光互补等一系列实验证明了在调控过程中YlRax1和YlRax2相互依赖，缺一不可，有直接的相互作用关系。蛋白的完整性在YlRax2发挥正常功能的过程中是必须的；YlRax1的N端100个氨基酸的缺失不影响其正常功能，但RGS结构域以及C端的跨膜区是其发挥功能所必须的。我们还筛选出新的可能的双极出芽地标蛋白YlBud3，发现该蛋白缺失后使细胞的出芽位点选择方式由双极出芽转变为随机出芽，并且细胞的形态也发生了改变，对YlBud3的功能及作用方式的研究还需要进一步的实验支持。鉴定了与酿酒酵母地标蛋白Bud8同源的蛋白YlBud8的功能，发现该蛋白并不参与调控细胞的双极出芽，而在细胞的分裂中发挥着重要的作用，其N端的Coiled-coil结构域在其发挥正常功能过程中是必须的。我们的研究结果揭示了解脂耶氏酵母中双极出芽地标蛋白YlRax1和YlRax2的功能及作用方式，增进了对该物种双极出芽调控机制的认识，进一步丰富了真菌的出芽位点选择的分子调控机制。