MicroRNAlet7b对TLR4介导的血小板贮存损伤的调控机制研究

Platelet activation and apoptosis during storage caused platelet storage lesion (PSL),PSL shortened storage period and the survival of activated platelets after transfusion.However,platelet activation and apoptosis mechanisms in vitro are still unclear.Previous studies have found microRNALet7b ,associated with apoptosis,expression in platelet changed significantly during storage, which binds to platelet activitedrelatedfactors TLR4-UTR region and regulates its transcription. The results indicated microRNAsLet7b-TLR4 pathway may play an important role in PSL.So the project will try to 1)explain PSL mechanisms by microRNAsLet7b-TLR4 pathway from the point of view of platelet activation and apoptosis,2) test the feasibility of reducing PSL from regulating microRNAsLet7b expression, 3) demonstrate the effect of microRNA Let7b-TLR4 pathway on stored platelet transfusion effects in vivo. Expected results will contribute not only to a better understanding of the mechanism of PSL, but also provide experimental and theoretical basis for finding a new platelet storage solution.

血小板贮存损伤（PSL）主要由血小板活化和凋亡引起，是引起血小板贮存时间短、回输患者体内活力下降的主要原因，严重影响血小板输注效果甚至造成血小板输注无效，然而，离体贮存血小板发生活化和凋亡的机制目前未明。前期研究发现microRNALet7b在血小板贮存过程中表达发生明显改变，并可与血小板活性正相关的TLR43-UTR区结合调控其表达，提示microRNAsLet7b-TLR4通路可能在其中起重要作用。本课题拟进行以下研究：1）从血小板活化和凋亡两个方面，探讨microRNALet7b-TLR4及其下游调控通路引起PSL的分子机制；2）验证以microRNALet7b为作用靶点降低PSL的可行性；3）小鼠体内试验证实microRNALet7b-TLR4对贮存血小板活力及输注效果的影响。预期结果将有助于进一步认识血小板贮存损伤的发生机制，同时也将为研发新型血小板保存液提供实验基础和理论依据。

血小板储存损伤（Platelet Storage Lesion, PSL）严重影响血小板保存质量和输注疗效，凋亡是导致PSL的主要诱因。本研究发现血小板储存期间microRNA let-7b呈差异表达，并可对血小板Bcl-xL进行转录后调控。基于高通量测序对血小板转录组mRNA和miRNA水平进行深度生物学信息分析，研究储存血小板RNA表达、降解机制，及mRNA和miRNA互作网络；然后通过蛋白表达、互作关系及miRNA转录后调控机制分析储存血小板Bcl-2蛋白家族调控线粒体介导凋亡的作用机制。通过靶基因预测发现microRNA let-7b可与Bcl-xL mRNA 3ʹ-UTR结合，进一步分析了血小板室温保存期间Bcl-2蛋白家族和microRNA let-7b的持续表达情况，进而分析microRNA let-7b靶向调控Bcl-2家族基因表达翻译的作用机制。实时定量PCR结果显示血小板储存期间microRNAlet-7b表达上调；Bcl-xL和Bak的互作影响血小板的凋亡；通过靶基因预测，构建Bcl-xL mRNA 3ʹ-UTR，双荧光素酶检测验证了microRNA let-7b调控Bcl-xL mRNA表达的作用；细胞转染确认let-7b能抑制Bcl-xL而促进Bak的蛋白翻译，而定量PCR结果显示mRNA没有发生明显变化，说明血小板储存期间存microRNAlet-7b对Bcl-xL的转录后调控作用。血小板室温保存期间，microRNA let-7b表达增加以抑制Bcl-xL的表达，导致Bak表达增加、促凋亡活性增强，促进血小板的凋亡。此外，我们还人工合成了miRNA let 7b 模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）两段核苷酸序列，发现let 7b mimic促进血小板的聚集，let 7b inhibitor能抑制血小板的聚集，进一步研究了let 7b inhibitor对血小板铺展，及血块回缩功能的抑制；同时let 7b inhibitor对血小板功能的抑制的机制研究进行了初步探讨。本项目研究结果有助于进一步认识血小板贮存损伤的发生机制，同时也将为研发新型血小板保存液提供实验基础和理论依据。