基于混池测序技术的黄姑鱼红头病抗病位点超精细定位

Hotou Disease is the most damaged Disease in Nibea albiflora with the mortality rate more than 50%, and there is no effective way to handle this disease. Disease resistance breeding can avoid the use of antibiotic, and thus protect the quality of culture water and meat. The study develops statistical method suitable for pool sequencing technique for ultra fine mapping of causative mutations, and applies it on the mapping of Hotou disease and accurate selection of molecular makers for breeding. Collecting big extreme-phenotypic population for susceptible and resistance fishes (>2000) and sequencing by pool DNA for two population, respectively; developing the corresponding statistical method for pool-sequencing GWAS and ultra fine mapping in GWAS region for increasing the accuracy of the detection; validating the cis-action of the mutation via eQTL analysis; employing MassArray technique to genotype 700~800 extreme phenotypic individuals for validating the GWAS mutations. The findings will provide basic prerequisite for disease-resistance breeding and disease mechanism dissection, and also provide new directions for genetic fine mapping of other economic traits for Nibea albiflora and other aquacultures.

红头病是近年来对黄姑鱼养殖业危害最大的疾病，50%以上幼鱼因此病而死亡，目前尚无有效防治方法。抗病育种可避免抗生素等药物使用，保护养殖水域及产品质量安全。本项目拟开发经济、有效的混池测序技术下因果突变的超精细定位方法，并应用于黄姑鱼红头病抗病位点的检测上，准确筛选抗病育种所需的分子标记。采集大样本（>2000尾）的黄姑鱼红头病极端易感及抗病个体DNA分别进行混合建库测序，开发针对性的全基因组关联分析（GWAS）及GWAS区域内因果突变精细检测的统计分析方法，提高因果突变的检测准确性；通过eQTL分析验证对基因表达起调控作用的突变；通过MassArray等技术对~800个极端易感和抗病个体进行SNP分型，进一步验证混池测序GWAS筛选到的主要突变。研究结果将为黄姑鱼红头病抗病选育及抗病遗传机理解析奠定基础，同时可为黄姑鱼其它经济性状的遗传解析和他种水产养殖生物的同类研究提供方法借鉴。

红头病是黄姑鱼养殖危害最严重的疾病，解析该性状的遗传机制对该病的分子选育具有重要意义。本项目开发了一种低成本的基于混池测序技术的关联分析方法，并将其用于黄姑鱼红头病的遗传解析中。我们成功开发了三种基于混池测序的统计分析方法，基于等位基因频率的卡方检验法、logistic回归法和G’法。然后，将新算法用于黄姑鱼抗红头病的遗传位点及功能基因的鉴定中，从来自福建省宁德市白基湾海区的池下、盘前和下浒三个渔场采集了635尾（三个地区分别为131、455和49尾）黄姑鱼红头易感（死亡）个体，9月份待该病不再有个体死亡后又采集1038尾健康个体。我们共建立了37个DNA库中，每个样本库平均包含30人，采用pair-end全基因组测序（150bp）技术对所有库进行深度测序，每个池的平均深度约为40×；对测序read进行质量控制和过滤后产生了每个SNP的等位基因频率。采用所建立混池测序卡方检验法发现了chr12、chr18和chr22上的GWAS信号，logit回归和修改G′值法也在chr4和chr12上发现了显著的GWAS区域。因此，我们对chr22和chr4上的区域进行功能基因注释，并在Chr22和chr4上鉴定到一些十分有趣的基因。其中一些存在于NF-κB信号通路上，如tifa、alpk1、mapk1和转录因子p65，也发现了nitr基因，该基因是一种特定的新型免疫型受体9。为了更好地解析功能基因，我们绘制了黄姑鱼肝脏组织的eQTL全景图，采集了240尾黄姑鱼的肝脏组织，并对这些个体DNA进行全基因组重测序，通过基因型及每个基因表达量建立了14407万个基因的顺式eQTL图谱，这里cis-eQTL被定义为基因附近1Mb区域，并分别绘制每个基因的曼哈顿图。这些eQTL的鉴定为本项目黄姑鱼抗红头病基因鉴定与解析提供了支撑。通过该eQTL数据库，我们将控制黄姑鱼红头病的功能基因缩小在tifa、alpk1、mapk1、p65和nitr中。最后，我们将chr22和chr4号染色体的两个位点分别开发成了分子标记，用于黄姑鱼的抗红头病的分子选育中。