靶向CRL 泛素连接酶抗肿瘤治疗诱导肝癌细胞自噬的分子机制及其潜在应用

CRL (Cullin-RING ubiquitin Ligase) is the largest E3 ubiquitin ligase family and serves as a new anticancer target against ubiquitin-proteasome system (UPS). Recently, we found that the inactivation of CRL for cancer therapy induces protective autphagy in cancer cells whereas blockage of autophagy pathway significantly enhances CRL inactivation-induced suppression of cancer cell growth by amplifying apoptosis. These findings suggest that autophagy response serves as a resistance mechanism to CRL-targeting therapy and blockage of autophagy pathway represents a novel strategy to enhance anticancer effects. In this study, we aim to (1)identify novel CRL substrates which regulate autophagy via a RNAi library-mediated high throughput screening, (2) elucidate the molecular mechanism for apoptosis induction upon autophagy blockage in CRL-inactivated cancer cells, and (3) evaluate the anticancer effect of combining autophagy inhibitor and CRL inhibitor. The successful completion of this work will not only significantly enhance our understanding on the role of CRL in regulation of autophagy, but also faciliate the development of a novel strategy to improve CRL inactivation-mediated anticancer therapy by targeting autophagy pathway.

CRL泛素连接酶家族是针对泛素－蛋白酶体降解系统的新型抗肿瘤药物研发靶点。最近，我们发现靶向CRL泛素连接酶抗肿瘤治疗可诱导肝癌细胞发生保护性自噬，而阻断自噬通路可以活化细胞凋亡，显著增强靶向CRL的抗肿瘤效果。这些发现提示自噬应答是肝癌细胞针对靶向CRL治疗的一种抗性机制，而阻断自噬通路则代表了一种新的联合增效策略。但迄今为止，CRL失活诱导肝癌细胞自噬和阻断自噬应答活化细胞凋亡的分子机制、及其自噬阻断剂的体内增效作用尚未阐明。本项目中，我们将高通量地鉴定参与调节自噬发生的CRL底物及通路，阐明在CRL灭活的肝癌细胞中阻断自噬通路后活化凋亡的分子机制，进而在体内检验阻断自噬对于靶向CRL抗肿瘤治疗的增效作用。项目成功完成不仅会加深我们对于CRL调控自噬应答分子机制的认识，而且为探索通过阻断自噬通路增强靶向CRL治疗的联合治疗新策略提供科学依据。

肝癌是常见的恶性肿瘤，严重危害人类健康，迫切需要研发新型干预策略。neddylation作为一种新的蛋白翻译后修饰方式，通过将NEDD8分子通过类泛素化途径催化与底物蛋白结合，调控蛋白的结构、降解和定位等功能。MLN4924作为neddylation通路的抑制剂，可抑制NEDD8活化酶的活性，灭活neddylation通路。由于对血液肿瘤和实体瘤具有良好的抗肿瘤效果及安全性，MLN4924已经处于Ⅰ/Ⅱ临床试验中。.. 研究表明，MLN4924可通过诱导CRL泛素连接酶底物积聚，诱导肝癌细胞凋亡。我们的研究表明，MLN4924还可引起CRL底物Deptor的积累，诱导Deptor-mTOR通路介导的细胞自噬。功能上，该细胞自噬在MLN4924抗肿瘤中起抗凋亡作用，促进肿瘤细胞存活，可诱发肝癌细胞对MLN4924产生潜在的耐药性，降低肿瘤细胞对MLN4924的敏感性。这些发现提示，提示阻断细胞自噬应答可能显著增强MLN4924的抗肿瘤效应。.. 为检验阻断自噬增强MLN4924的抗肿瘤效果并阐明其作用机制，我们利用药物（氯喹，CQ）和遗传学（干扰ATG7）手段阻断细胞自噬应答过程，结果发现：(1) 阻断细胞自噬应答反应可显著增强MLN4924诱导肝癌细胞凋亡及增殖抑制; (2) 自噬阻断剂氯喹增强MLN4924诱导的肝癌细胞凋亡主要通过NOXA介导的。氯喹联合MLN4924引起NOXA的显著积累及转录上调，利用siRNA干扰NOXA的表达，可极显著地缓解氯喹联合MLN4924引起的细胞凋亡和增殖抑制; (3) 在机制上，MLN4924-CQ 联合应用诱导的强烈DNA损伤和活性氧自由基产生联合激活NOXA转录和细胞凋亡; (4) 通过构建小鼠肝原位移植瘤模型，在体内验证了自噬阻断剂氯喹可增强MLN4924的抗肝癌效果。利用免疫组化技术，我们发现氯喹联合MLN4924可显著上调小鼠肝癌组织中NOXA和c-Caspase 3的表达，同时显著下调肝癌组织中Ki-67的表达，即氯喹联合MLN4924抗肝癌机制是通过协同诱导细胞凋亡所介导。.. 综上所述，阻断细胞自噬可通过诱导NOXA介导的细胞凋亡显著增强MLN4924抗肝癌效果，这一发现为通过联合阻断细胞自噬和CRL通路抗肝癌治疗提供了坚实的科学依据。