携带CRISPR/Cas和供体DNA的高容量腺病毒介导的体内细胞高效靶向修饰方法的探究

Monogenic diseases are caused by mutations in a single gene which can be transmitted to offspring, gene knock-in mediated by CRISPR/Cas is suitable for the therapy of these kinds of diseases. However, gene knock-in efficiency is still to be improved before it can be used in vivo. In this project, we will use the third generation adenovirus with high capacity, low immunogenicity and no risk of chromosome insertion, to carry CRISPR/Cas and donor to improve the efficiency and security of gene knock-in. Next, according to the different cell dividing state of neonatal and adult mice, homologous recombination pathway will be used to treat neonatal mouse and non-homologous end joining pathway will be utilized to treat adult mouse. Moreover, the therapy gene fused with a TAT-PTD cell transduction peptide in the 3 terminal will be inserted downstream of mouse albumin gene to make it express with high level under the control of mouse albumin promoter. The secreted fusion proteins will efficiently permeate into other unmodified cells with the help of TAT-PTD to improve the cross-correction efficiency. Finally, Mucopolysaccharidosis type VII mouse model was used to evaluate this technical protocol. Consequently, our study will lay a foundation for the treatment of monogenetic diseases in clinics.

单基因遗传性疾病是由一对等位基因的突变造成的可遗传的疾病，CRISPR/Cas介导的靶向基因插入技术在该类疾病治疗中具有很好的应用价值，但是如何提高体内靶向基因插入的效率是仍待解决的问题。在本课题中，我们将采用具有高容量、低免疫源性及不插入染色体等优点的第三代腺病毒携带CRISPR/Cas和供体DNA，提高靶向基因插入的效率和安全性；针对体细胞分裂较快的幼年期小鼠采用同源重组方式，针对体细胞多数处于静止期的成年期小鼠采用非同源末端连接方式，从而提高体内不同分裂状态细胞的靶向插入效率；将3´端融合细胞转导肽TAT-PTD的治疗基因靶向插入到白蛋白基因下游，借助于白蛋白的强启动子大量表达治疗基因，表达产物分泌后在TAT-PTD的引导下高效地进入其它未被修饰的细胞，从而提高交叉纠正效率。最后以黏多糖储积症VII小鼠模型为治疗对象，对该技术方案进行了评估，为临床上单基因遗传性疾病的治疗奠定基础。

单基因遗传性疾病是由一对等位基因的突变造成的可遗传的疾病，CRISPR/Cas介导的靶向基因插入技术在该类疾病治疗中具有很好的应用价值，但是如何提高体内靶向基因插入的效率是仍待解决的问题。在本课题中，我们首先建立了一种新的高容量腺病毒包装方法，有效的提高了高容量腺病毒包装效率，降低了辅助病毒的污染；采用高容量腺病毒携带Crispr和用于同源重组的供体DNA在白蛋白基因的3‘端靶向插入T2A-TAT-GUS，借助白蛋白启动子的强启动活力同时又不破坏白蛋白基因的表达，TAT小肽的利用提高了纠正的细胞分泌表达产物后对其它细胞的旁效应；最后以黏多糖储积症VII小鼠模型为治疗对象，对该技术方案进行了评估，为临床上单基因遗传性疾病的治疗奠定基础。在项目经费的资助下，我们已成功的构建了高容量腺病毒及辅助病毒相关的一系列载体，并建立了包装纯化的方法，通过高容量腺病毒携带Crispr和供体DNA进行体外及体内治疗的研究，取得了良好的效果。这些研究成果有助于高容量腺病毒在基因治疗中的应用，也有助于Crispr介导的靶向基因插入技术在单基因遗传性疾病治疗中的应用，具有重要的应用价值。