角质形成细胞通过TLR2/MYD88途径介导巨噬细胞极化在孢子丝菌病发病中的机制研究

The histopathologic manifestation of sporotrihosis is inflammatory granuloma due to participation of macrophage. There is a close relationship between macrophage polarization and infectious disease. We found an increase of IFN-γ and a decrease of IL-4 in the epidermis of lesions of sporotrichosis patients, which was the same with the condition of M1 macrophage polarization, but it’s unclear about the role of macrophage polarization in the pathogenesis of sporotrichosis. It has been accepted that keratinocytes (KC) play an important role in the immunity response, and it was reported that KC induced by chemicals could influence the polarization of macrophage, besides, we found KC could endocytose Sg. in vitro, and TLR2/MYD88 signal pathway was activated in the lesions of sporotrichosis patients, so we speculated KC would develop immune responses to Sg. and induce an excessive M1-polarized macrophage via TLR2/MYD88 pathway and then lead to a chronic granulomatous inflammation. In this project, we are going to clarify the immune responses of KC to Sg. and its influences on the macrophage polarization, and make further efforts to reveal the regulatory role of TLR2/MYD88 pathway through the technology such as RNAi, flow cytometry, etc. This project will provide us new ideas on elucidating the pathogenesis and searching new therapy of sporotrichosis.

孢子丝菌病病理表现为真皮内巨噬细胞参与形成的炎性肉芽肿，而巨噬细胞极化与感染性疾病关系密切。我们已证实孢子丝菌病患者皮损组织的表皮内IFN-γ表达增高而IL-4降低，这与M1型巨噬细胞极化条件相吻合，但孢子丝菌病中巨噬细胞如何极化尚无定论。目前认为，角质形成细胞（KC）在机体免疫应答中扮演着重要的角色，研究发现KC经化学物刺激后可影响巨噬细胞的极化，此外我们在体外实验中发现KC可内吞球形孢子丝菌（Sg.），并且患者皮损内TLR2/MYD88信号通路被激活，故此我们推测KC可能通过TLR2/MYD88通路调控对Sg.的免疫应答并诱导巨噬细胞向M1型方向过度极化，继而导致慢性肉芽肿性炎症。本项目拟应用RNAi、流式细胞术等方法，以明确KC在Sg.感染过程中对巨噬细胞极化的影响，并揭示TLR2/MYD88通路在其中的调控作用。本项目的完成可为阐明孢子丝菌病的发病机制及探索其新疗法提供新思路。

孢子丝菌病是一种常见的皮肤深部真菌病，该病的致病机制和感染途径并不十分清楚。而角质形成细胞作为皮肤抵御感染的第一防线，在孢子丝菌病感染中的作用尚不明确。因此本研究首先发现新生儿角质形成细胞（HEKn）可以通过分泌抗菌肽和ROS杀伤球形孢子丝菌（Sg.）；Sg.可以诱导HEKn分泌IL-8和CXCL-1；利用Transwell 实验，我们发现HEKn和Sg.共孵育后可以募集THP-1细胞，然而进一步通过流式分析结果显示，对THP-1细胞极化无影响。另外，两者共孵育的上清可以诱导THP-1细胞表达IL-6。同时，我们根据细胞因子的表达情况，发现HEKn和Sg.共孵育后可以大量趋化人中性粒细胞。与巨噬细胞相比，HEKn与Sg.共培养的上清液能够刺TNF-α、IL-6和IFN-γ。通过Western blot方法，我们发现Sg.可以激活TLR2/MyD88/NF-kB信号通路，酵母细胞活化能力更强。当TLR2经siRNA表达受抑制时，Sg.酵母细胞和分生孢子诱导细胞表达IL-8和CXCL-1的水平明显下降，而且感染HEKn细胞后对募集THP-1细胞和中性粒细胞的效率均显著降低。回顾分析704例吉林省儿童孢子丝菌病的流行病学特征发现，儿童孢子丝菌病的发病季节在冬天高发，皮损部位以面部为主，且多表现为固定型孢子丝菌病、年龄较小的患者发病率明显高于年龄较大的儿童；分析比较儿童和成人孢子丝菌病例发现，儿童和成人孢子丝菌病患者在性别、发病季节、皮损部位和临床类型的分布存在显著差异。通过分析儿童及比较儿童与成人孢子丝菌病的流行病学特征，我们提出了儿童孢子丝菌病感染途径的假说。结合上述实验内容，也证实了角质形成细胞的完整性是抵御孢子丝菌病感染的关键。在后续实验中，我们将继续探讨患者皮损中的巨噬细胞和中性粒细胞的分子调控机制。