高产广谱细菌素工程菌的构建表达和特性研究

在前期研究基础上，为解决前期筛选的野生菌株产生的细菌素分离纯化困难和产量低的问题，本项目拟利用已知的益生菌来源的高效广谱细菌素的基因序列，通过切割、拼接、序列氨基酸替代和修饰、组合（杂合）等方法，人工设计合成抗菌活性更强、抗菌谱更广、但不抑制肠道优势菌群（如乳酸菌）的新型细菌素基因，然后将新基因克隆表达于毕赤酵母中，成功构建出高产高活性广谱细菌素的工程菌，优化诱导表达和培养条件，获得高产量高活性的细菌素，经分离纯化获得高纯度细菌素，进一步研究其抗菌特性、生化特性（稳定性）以及对猪禽的应用效果。项目的完成极有可能探索出设计开发新型细菌素的新方法和新思路，进而为开发畜禽和水产用抗生素替代品乃至为开发新型生物医药、新型食品生物防腐剂、植物生防剂提供公用新方法、新技术；也为其它细菌素工程菌的构建奠定理论和技术基础。

细菌素是由细菌通过核糖体途径产生的具有抗菌活性的肽和蛋白类物质。相对于通过酶促反应形成的抗生素，细菌素具有安全性、无残留、高稳定、特异性抑杀病原菌等优良特性，是抗生素替代品的理想选择。细菌素lacticin Q（简称LQ）和 bacteriocin E50-52（简称BE50-52）具有抗菌活力高、益生菌来源、特异性抑杀病原菌、pH和高温耐受性好等优良特性。本项目主要进行LQ和 BE50-52在三种不同表达系统的表达方法、生物学特性和动物应用效果研究。结果表明，成功在毕赤酵母和大肠杆菌中进行了LQ和 BE50-52的高效表达，在枯草芽孢杆菌中进行了LQ的高效表达。在毕赤酵母表达中，分别将细菌素LQ和 BE50-52基因与pGAPZaA载体连接，构建重组载体，转化毕赤酵母SMD1168，重组细菌素经超滤、反相色谱及分子筛层析等纯化，获得了纯度90%以上的重组细菌素，产量分别为0.9 和1.1 mg/L。在大肠杆菌表达中，分别将LQ和 BE50-52基因克隆到pET SUMO质粒构建表达载体，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，使细菌素与SUMO融合表达，经IPTG诱导，融合细菌素实现了胞内表达，通过酶切及两轮Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化获得了纯度95％以上的重组细菌素，产量可分别高达32、16 mg/L。在枯草芽孢杆菌表达中，应用分子伴侣（SUMO）技术，将融合SUMO-LQ基因克隆到pWB980质粒构建表达载体，转化枯草芽孢杆菌宿主WB600，实现了LQ的组成型分泌表达，经两轮Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化后可得纯度93%以上重组LQ，产量为5.3 mg/L。以上研究结果表明，本项目成功进行了重组细菌素在三种载体的高效表达。而且特性分析表明，纯化后的重组细菌素分子量与理论分子量一致，对金黄色葡萄球菌等指示菌具有良好的抑菌活性，具有较宽的pH和高温耐受性；动物试验表明，重组细菌素能够显著降低(p<0.05)金黄色葡萄球菌引起的小鼠炎性反应，有较好的抑菌活性。LQ和 BE50-52高效表达和纯化为重组细菌素或抗菌肽的高效表达和纯化提供了具体的表达系统、表达方法、参数和理论依据，而且为抗生素替代品的开发提供了新思路、新方法、新技术。